Ključna razlika – RT PCR vs QPCR
Lančana reakcija polimeraze je tehnika koja se koristi za umnožavanje specifične regije DNK in vitro. Zahvaljujući izumu ove tehnike od strane Karyja Mullisa 1983. godine, znanstvenici su u mogućnosti napraviti tisuće do milijune kopija specifičnih fragmenata DNK za potrebe istraživanja. Trenutno je to postala uobičajena i rutinski korištena tehnika u kliničkim i istraživačkim laboratorijima za široku paletu primjena. Postoje varijacije tradicionalne PCR tehnike kao što su RT PCR, ugniježđeni PCR, multipleks PCR, Q PCR, RT – QPCR itd. RT PCR i Q PCR dvije su važne varijante PCR-a. Ključna razlika između RT PCR i Q PCR je u tome što se RT PCR koristi za otkrivanje ekspresije gena stvaranjem komplementarnih DNA (cDNA) transkripata iz RNA, dok se Q PCR koristi za kvantitativno mjerenje PCR proizvoda u stvarnom vremenu pomoću fluorescentnih boja.
Što je RT PCR?
Reverzna transkripcija lančane reakcije polimerazom (RT PCR) je varijanta PCR-a koja se koristi za otkrivanje ekspresije RNA. To je vrlo važna metoda za otkrivanje ekspresije mRNA u tkivima. RT PCR se koristi kada je početni materijal uzorka RNA. U RT PCR-u, predloška mRNA prvo se pretvara u komplementarnu DNA. Ovaj korak katalizira enzim reverzna transkriptaza, a proces je poznat kao reverzna transkripcija. Drugo, tradicionalni PCR se koristi za novo sintetiziranu cDNA za pojačanje.
RT PCR je vrlo osjetljiva tehnika koja zahtijeva relativno malu količinu RNA uzorka. RT PCR se obično koristi u dijagnostici i kvantifikaciji RNA vrsta, posebno RNA virusa kao što su virus humane imunodeficijencije i virus hepatitisa C.
Slika 01: RT PCR tehnika
Što je QPCR?
Kvantitativni PCR (QPCR) je varijanta PCR-a koja se koristi za kvantitativno mjerenje PCR proizvoda. Naziva se i lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu budući da mjeri pojačanje u stvarnom vremenu pomoću PCR stroja u stvarnom vremenu. To je prikladna metoda za određivanje količine ciljne sekvence ili gena prisutnog u uzorku. Zanimljiva značajka QPCR-a je da kombinira pojačanje i pravu kvantifikaciju u jedan korak. Stoga se QPCR tehnikom može eliminirati potreba za gel elektroforezom u detekciji. QPCR koristi fluorescentne boje za označavanje PCR proizvoda tijekom PCR reakcija koje na kraju dovode do izravne kvantifikacije. Kada se akumuliraju PCR proizvodi, akumuliraju se i fluorescentni signali i to će mjeriti stroj u stvarnom vremenu. QPCR se može kombinirati s RT PCR. Poznata je kao RT – QPCR ili QRT – PCR i smatra se najsnažnijom, najosjetljivijom i kvantitativnom metodom za detekciju razine RNA u stanicama ili tkivima.
SYBR Green i Taqman dvije su metode koje se koriste za otkrivanje ili promatranje procesa amplifikacije PCR-a u stvarnom vremenu. SYBR Green metoda provodi se korištenjem fluorescentne boje nazvane SYBR green i otkriva pojačanje vezanjem boje za proizvodnju dvolančane DNA. Taqman se provodi korištenjem dvostruko obilježenih sondi i otkriva pojačanje razgradnjom sonde Taq polimerazom i oslobađanjem fluorofora kao što je prikazano na slici 02. Obje metode prate napredak procesa pojačanja i izvješćuju o količini proizvoda u stvarnom vremenu.
PCR u stvarnom vremenu ima široku paletu primjena kao što je kvantifikacija ekspresije gena, analiza mikroRNA i nekodirajuće RNA, genotipizacija SNP-a, otkrivanje varijanti broja kopija, otkrivanje rijetkih mutacija, otkrivanje genetski modificiranih organizama, otkrivanje infektivnih agenasa, itd.
Slika 02: Kvantitativna PCR tehnika
Koja je razlika između RT PCR i QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR je tehnika koja se koristi za otkrivanje ekspresije gena umnožavanjem. | QPCR je tehnika koja pojačava DNK i kvantificira PCR proizvode u stvarnom vremenu. |
| Uključenost enzima reverzne transkriptaze | |
| Enzim reverzna transkriptaza koristi se za RT PCR. | Enzim reverzna transkriptaza ne koristi se za QPCR. |
| Upotreba fluorescentno obilježenih molekula | |
| Fluorescentno obilježene boje ili sonde ne koriste se za RT PCR. | Fluorescentno obilježene boje ili sonde koriste se za QPCR. |
| Kvantifikacija PCR proizvoda | |
| Osim ako nije spojen s QPCR-om, RT PCR ne kvantificira PCR produkt. | QPCR kvantitativno mjeri PCR produkt. |
| Početni materijal | |
| Polazni materijal je mRNA. | Polazni materijal je DNK. |
| Sinteza cDNA | |
| Komplementarna DNK se proizvodi tijekom RT PCR. | Komplementarna DNK se ne proizvodi tijekom QPCR-a. |
Sažetak – RT PCR vs QPCR
RT PCR i QPCR dvije su verzije tradicionalnog PCR-a. Tehnika RT PCR provodi se za uzorke mRNA i pokreće se reverznom transkripcijom i proizvodnjom cDNA. QPCR se koristi za kvantificiranje PCR proizvoda tijekom toplinskih PCR ciklusa u stvarnom vremenu korištenjem fluorescentnih boja ili obilježenih sondi. U QPCR-u, količina PCR proizvoda predstavljena je emitiranim fluorescentnim signalima uzorka. RT PCR se popularno koristi kao postupak pojačanja, dok se QPCR obično koristi kao postupak kvantifikacije. Ovo je razlika između RT PCR i QPCR.
