Ključna razlika – Maxam Gilbert vs Sanger sekvenciranje
Nukleotidi su osnovne strukturne jedinice i građevni blokovi DNK. Molekula DNA sastoji se od polinukleotidnog lanca. U DNK se nalaze četiri različita nukleotida. Ovi nukleotidi se sastoje od četiri različite dušične baze nazvane A (adenin), G (gvanin), C (citozin), T (timin). Redoslijed nukleotida u molekuli DNA ima veliku važnost jer kodira važnu genetsku informaciju za rast i razvoj organizma. Sekvenciranje DNA odnosi se na proces kojim se utvrđuje točan nukleotidni slijed DNA. Postoje različite metode sekvenciranja DNK. Maxam Gilbert sekvenciranje i Sanger DNA sekvenciranje dvije su metode sekvenciranja DNA koje pripadaju prvoj generaciji sekvenciranja. Postupak sekvenciranja po Maxamu Gilbertu određuje bazni slijed kemijskim cijepanjem DNK fragmenata označenih na 5’ kraju ponajprije na svakom od četiri nukleotida i elektroforezom u gelu. Sangerov postupak sekvenciranja određuje slijed nukleotida sintetiziranjem jednolančane DNA pomoću DNA polimeraze i dideoksinukleotida te gel elektroforeze. Ovo je ključna razlika između Maxama Gilberta i Sanger Sequencinga.
Što je Maxam Gilbert sekvenciranje?
Maxam Gilbert sekvenciranje, također poznato kao metoda kemijskog sekvenciranja, tehnika je koja je razvijena za određivanje redoslijeda nukleotida u DNK. Ovu su metodu predstavili W alter Gilbert i Alan Maxam 1976. godine i postala je popularna jer se može izvoditi izravno s pročišćenom DNK. Metoda Maxama Gilberta pripada prvoj generaciji sekvenciranja DNK i bila je prva metoda sekvenciranja koju su znanstvenici naširoko koristili.
Osnovno načelo ove metode leži u ograničavanju krajnje obilježenih fragmenata DNK na određenim bazama pomoću kemikalija i uvjeta specifičnih za baze i odvajanju označenih fragmenata elektroforezom kao što je prikazano na slici 01. Fragmenti se odvajaju prema na njihove veličine na gelu. Budući da su fragmenti označeni, slijed molekule DNA može se lako zaključiti.
Maxam gilbertova metoda koristi kemikalije specifične za baze za razbijanje DNK na određenim bazama. Dvije uobičajene kemikalije pod nazivom dimetilsulfat i hidrazin kemikalije koriste se za selektivni napad na purine i pirimidine.
Maxam Gilbert metoda sekvenciranja provodi se kroz nekoliko koraka kako slijedi.
- Pročišćavanje sekvence DNA pomoću restrikcijskih endonukleaza
- Označavanje krajeva DNA fragmenata dodavanjem radioaktivnih fosfata
- Pročišćavanje označenih fragmenata od neobilježenih fragmenata elektroforezom u gelu
- Razdvajanje krajnje označene DNK u četiri epruvete i odvojeno tretiranje kemikalijama specifičnim za bazu
- Elektroforeza sadržaja svake epruvete na posebnim linijama na gelu i odvajanje fragmenata prema njihovoj duljini.
- Detekcija fragmenata autoradiografijom.
Slika 01: Maxam Gilbert Sekvenciranje
Što je Sanger sekvenciranje?
Sangerovo sekvenciranje je metoda sekvenciranja koju su 1977. godine razvili Frederick Sanger i njegovi kolege kako bi odredili baznu sekvencu danog fragmenta DNK. Također je poznata kao metoda sekvenciranja prekida lanca ili metoda dideoksi sekvenciranja. Ova metoda radi na principu selektivne inkorporacije dideoksinukleotida koji završavaju lanac (ddNTP) kao što su ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP pomoću DNA polimeraze tijekom sinteze jednolančane DNA za prekid formiranja lanca. Dideoksinukleotidima nedostaju 3’ OH skupine za stvaranje fosfodiesterskih veza sa susjednim nukleotidom. Dakle, formiranje lanca prestaje kada se ddNTP ugradi u novonastali lanac tijekom sangerovog sekvenciranja.
U ovoj metodi izvode se četiri odvojene reakcije sinteze DNK (PCR) u četiri odvojene epruvete s jednom vrstom ddNTP. Ostali zahtjevi također su isporučeni za epruvete za PCR uključujući početnice, dNTP, Taq polimerazu, specifične uvjete, itd. Četiri odvojene reakcije izvode se u četiri epruvete s četiri smjese. Nakon PCR reakcija, rezultirajući DNA fragmenti se toplinski denaturiraju i odvajaju gel elektroforezom. Zatim se fragmenti vizualiziraju pomoću obilježenog (radioaktivnog ili fluorescentnog) primera ili dNTP-a kao što je prikazano na slici 02.
Slika 02: Sanger sekvenciranje
Koja je razlika između Maxama Gilberta i Sanger Sequencinga?
Maxam Gilbert vs Sanger Sekvenciranje |
|
| Maxam Gilbert sekvenciranje je prva tehnika razvijena za sekvenciranje DNK. | Sangerova metoda sekvenciranja uvedena je nakon metode sekvenciranja Maxama Gilberta. |
| Upotreba | |
| Ova metoda se rijetko koristi. | Sangerovo sekvenciranje se rutinski koristi za sekvenciranje. |
| Korištenje opasnih kemikalija | |
| Koristi opasne kemikalije. | Upotreba opasnih kemikalija ograničena je u usporedbi s metodom Maxama Gilberta. |
| Označavanje za otkrivanje | |
| Ova metoda koristi radioaktivni P32 za označavanje krajeva fragmenata DNK. | Sangerovo sekvenciranje koristi radioaktivno ili fluorescentno obilježene ddNTP-ove. |
Sažetak – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert i Sanger sekvenciranje dvije su vrste tehnika sekvenciranja DNK koje spadaju u prvu generaciju sekvenciranja DNK. Maxam Gilbert sekvenciranje prva je metoda uvedena za sekvenciranje DNK 1976. godine, a izvodi se lomljenjem krajeva označenih fragmenata DNK pomoću kemikalija specifičnih za bazu. Stoga je poznato kao kemijsko sekvenciranje. Sangerova metoda sekvenciranja uvedena je 1977. godine, a temelji se na reakcijama terminacije lanca koje pokreće ddNTP. Sangerova metoda sekvenciranja popularnija od metode Maxama Gilberta zbog nekoliko nedostataka metode Maxama Gilberta kao što su pretjerana potrošnja vremena, upotreba opasnih kemikalija itd. Ovo je razlika između sekvenciranja Maxama Gilberta i Sangera.
