Ključna razlika između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u stvarnom vremenu je u tome što je konvencionalni PCR tehnika razvijena za umnožavanje specifičnih sekvenci DNK, a ugniježđeni PCR je modifikacija konvencionalnog PCR-a koji se sastoji od dvije sekvencijalne reakcije pojačanja, dok je pravi -time PCR je varijanta konvencionalnog PCR-a koja može kvantificirati pojačani produkt.
PCR je vrlo uobičajena znanstvena tehnika koja se široko koristi u istraživanju i medicini za otkrivanje DNK. PCR testovi se koriste za otkrivanje antigena otkrivanjem njihove DNA ili RNA. Općenito, virusna RNA prisutna je u tijelu prije otkrivanja protutijela ili pokazivanja simptoma bolesti. PCR test može rano otkriti ima li netko virus ili ne. Trenutno je PCR standardni test za otkrivanje bolesti COVID-19. Postoje različite vrste PCR tehnika kao što su PCR u stvarnom vremenu, ugniježđeni PCR, multipleksni PCR, vrući startni PCR i dugotrajni PCR, itd.
Što su konvencionalni PCR testovi?
Konvencionalni PCR test je in vitro tehnika pojačanja DNA koja se rutinski provodi u molekularno biološkim laboratorijima. Ova metoda omogućila je proizvodnju tisuća do milijuna kopija određenog fragmenta DNK. Kary Mullis uveo je ovu tehniku 1980. Ova tehnika zahtijeva fragment DNK poznat kao predložak kako bi se napravilo mnogo njegovih kopija. Taq polimeraza djeluje kao enzim DNA polimeraza i katalizira sintezu novih niti predloške sekvence.
Primeri u smjesi za PCR djelovat će kao početne točke za ekstenzije fragmenata. Svi sastojci koji su potrebni za izradu kopija DNK uključeni su u PCR smjesu. PCR reakcija izvodi se u PCR stroju i treba ga hraniti ispravnom PCR smjesom i ispravnim PCR programom. Ako su reakcijska smjesa i program ispravni, proizvest će potreban broj kopija određenog dijela DNK iz vrlo male količine DNK.
Slika 01: Konvencionalni PCR test
Postoje tri glavna koraka uključena u PCR reakciju: denaturacija, žarenje primera i produženje niti. Ova tri koraka odvijaju se na tri različite temperature. PCR pufer održava optimalne uvjete za djelovanje Taq polimeraze. Ove tri faze PCR reakcije se ponavljaju kako bi se proizvela potrebna količina PCR produkta. Pri svakoj PCR reakciji broj DNK kopija se udvostručuje. Stoga se u PCR-u može uočiti eksponencijalno pojačanje. PCR produkt može se razdvojiti pomoću gel elektroforeze budući da proizvodi vidljivu količinu DNK na gelu i može se pročistiti za daljnja istraživanja kao što je sekvenciranje.
PCR je vrijedan alat u medicinskim i biološkim istraživanjima. Osobito u forenzičkim studijama, PCR ima golemu vrijednost budući da može pojačati DNK za studije iz sićušnih uzoraka kriminalaca i izraditi forenzičke DNK profile. PCR se naširoko koristi u mnogim područjima molekularne biologije, uključujući genotipizaciju, kloniranje gena, detekciju mutacija, sekvenciranje DNK, mikronizove DNK i testiranje očinstva.
Što su ugniježđeni PCR testovi?
Ugniježđeni PCR je vrsta PCR-a koja smanjuje nespecifično umnožavanje DNA. Postoje dva uzastopna PCR-a ili dvije sekvencijalne reakcije pojačanja u ugniježđenom PCR testu. Tijekom prve reakcije umnožavanja proizvodi se PCR produkt. Nakon prve reakcije, provodi se druga reakcija pojačanja na PCR produktu prve reakcije. Stoga se početnice u drugoj reakcijskoj smjesi vežu s prvim PCR produktom i pojačavaju ga.
Slika 02: Ugniježđeni PCR
Parovi prajmera različiti su u svakoj reakciji. Nespecifično vezanje početnica je smanjeno u ugniježđenoj PCR. Ugniježđeni PCR testovi korisni su za povećanje osjetljivosti i/ili specifičnosti. Međutim, ugniježđeni PCR zahtijeva znanje o slijedu koji nas zanima.
Što su PCR testovi u stvarnom vremenu?
PCR u stvarnom vremenu ili kvantitativni PCR (Q PCR) je modificirana verzija PCR-a koja kvantitativno mjeri PCR proizvode. Stoga ova tehnika kvantificira pojačanje u stvarnom vremenu pomoću PCR stroja u stvarnom vremenu. To je također prikladna metoda za određivanje količine ciljne sekvence ili gena prisutnog u uzorku.
Zanimljiva značajka PCR-a u stvarnom vremenu je da kombinira pojačanje i pravu kvantifikaciju u jednom koraku. Stoga se potreba za gel elektroforezom za detekciju može eliminirati PCR tehnikom u stvarnom vremenu. Upotreba fluorescentnih boja za označavanje PCR produkata tijekom PCR reakcija na kraju će dovesti do izravne kvantifikacije. Kada se akumuliraju PCR produkti, akumuliraju se i fluorescentni signali, koje će mjeriti stroj u stvarnom vremenu. SYBR Green i Taqman dvije su metode za otkrivanje ili promatranje procesa amplifikacije PCR-a u stvarnom vremenu. Obje metode prate napredak procesa pojačanja i izvješćuju o količini proizvoda u stvarnom vremenu.
Slika 03: PCR u stvarnom vremenu
PCR u stvarnom vremenu ima široku paletu primjena kao što je kvantifikacija ekspresije gena, analiza mikroRNA i nekodirajuće RNA, genotipizacija SNP-a, otkrivanje varijanti broja kopija, otkrivanje rijetkih mutacija, otkrivanje genetski modificiranih organizama i otkrivanje uzročnika infekcije.
Koje su sličnosti između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u stvarnom vremenu?
- Ugniježđeni testovi i PCR testovi u stvarnom vremenu modifikacije su konvencionalnih PCR testova.
- Sve tri tehnike pojačavaju uzorke DNK.
- Njihovi se proizvodi mogu koristiti u sekvencioniranju ili analizi.
- Ovi testovi zahtijevaju početnice.
Koja je razlika između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u stvarnom vremenu?
Konvencionalni PCR je tehnika razvijena za umnožavanje specifičnih sekvenci DNK. S druge strane, Nested PCR je modifikacija konvencionalne PCR koja se sastoji od dvije sekvencijalne reakcije pojačanja, a PCR u stvarnom vremenu je varijanta konvencionalne PCR koja može kvantificirati umnoženi produkt. Dakle, ovo je ključna razlika između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u stvarnom vremenu. Za razliku od konvencionalnog PCR-a i PCR-a u stvarnom vremenu, ugniježđeni PCR koristi dva skupa primera. Štoviše, postoje dvije uzastopne reakcije amplifikacije u ugniježđenoj PCR kako bi se smanjila nespecifična amplifikacija. osim toga, konvencionalni i PCR testovi u stvarnom vremenu ne sadrže dvije sekvencijalne reakcije pojačanja.
Sljedeća infografika navodi razlike između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u stvarnom vremenu u obliku tablice za usporedbu.
Sažetak – Konvencionalni nasuprot ugniježđenim nasuprot PCR testovima u stvarnom vremenu
Konvencionalni PCR je prva tehnika razvijena za umnožavanje specifičnih fragmenata DNK. Ugniježđeni PCR i PCR u stvarnom vremenu dvije su varijante konvencionalnog PCR-a. Postoje dvije sekvencijalne reakcije amplifikacije i upotreba dva seta primera u ugniježđenoj PCR. PCR u stvarnom vremenu razvijen je za kvantificiranje umnoženog PCR produkta. Dakle, ovo sažima razliku između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u stvarnom vremenu.
