PCR u odnosu na PCR u stvarnom vremenu
PCR ili lančana reakcija polimeraze revolucionarno je otkriće u modernoj molekularnoj biologiji, koje je prvi razvio kemičar Kary Mullis 1983. Omogućuje umnožavanje jedne sekvence u složenoj DNK za analizu. Osnovna ideja PCR-a je da su dva početnica, koja su komplementarna suprotnim lancima DNA sekvence, usmjerena jedna prema drugoj; početnice proizvode komplementarne niti, od kojih svaka sadrži drugu početnicu. Stoga je rezultat velika količina sekvence koja odgovara DNK koja se nalazi između dva početnica. Enzim DNA polimeraza koristi se za produljenje početnica u PCR. DNA polimeraza je termostabilan enzim i ima sposobnost preživljavanja na visokim temperaturama (94 do 95 °C) koje se koriste za denaturaciju DNA predloška.
PCR uključuje tri koraka, naime, ponovljene runde denaturacije, žarenje početnica i sintezu DNA. Za izvođenje ove reakcije koristi se termociklički stroj tako da se može programirati za brzu i točnu promjenu temperature. Primjene PCR-a su kriminalističke istrage, DNK otisak prsta, otkrivanje patogena i analiza DNK rane ljudske vrste.
Što je konvencionalni PCR?
Postoje tri glavne faze konvencionalnog PCR-a, naime; Stadij amplifikacije DNA, odvajanje PCR-a i detekcija produkata. Odvajanje segmenata DNA obično se provodi elektroforezom u agaroznom gelu. Produkti se zatim boje etheiduim bromidom. Konačno, detekcija se postiže vizualizacijom traka na gelovima pod UV svjetlom. Stoga se konačni rezultati konvencionalne PCR ne izražavaju brojevima. Obično konvencionalni PCR može otkriti samo jedan parametar.
Što je PCR u stvarnom vremenu?
PCR u stvarnom vremenu može otkriti umnožavanje proizvoda, dok se proizvodi sintetiziraju. S razvojem tehnologije PCR je postao vrlo popularna tehnika, posebice za detekciju i identifikaciju bakterija u hrani. PCR u stvarnom vremenu koristi sustav fluorescentne boje i termocikler opremljen mogućnošću fluorescentne detekcije.
Koja je razlika između konvencionalnog PCR-a i PCR-a u stvarnom vremenu?
• Konvencionalni PCR oduzima više vremena jer koristi gel elektroforezu za analizu umnoženih PCR proizvoda. Nasuprot tome, PCR u stvarnom vremenu oduzima manje vremena jer može otkriti pojačanja tijekom ranih faza reakcije.
• PCR u stvarnom vremenu prikuplja podatke u eksponencijalnoj fazi rasta PCR-a dok tradicionalni PCR prikuplja podatke na krajnjoj točki reakcije.
• Rezultati krajnje točke konvencionalnog PCR-a možda nisu vrlo precizni, ali rezultati PCR-a u stvarnom vremenu vrlo su precizni.
• PCR u stvarnom vremenu je osjetljiviji od konvencionalnog PCR-a.
• Konvencionalni PCR ima vrlo lošu rezoluciju dok PCR u stvarnom vremenu može otkriti vrlo male promjene zbog visoke rezolucije.
• Detekcija krajnje točke konvencionalnog PCR-a ima kratki dinamički raspon dok detekcija PCR-a u stvarnom vremenu ima širok dinamički raspon.
• Za razliku od konvencionalnog PCR-a, tehnike automatizirane detekcije nalaze se u PCR-u u stvarnom vremenu.
• Konvencionalni PCR je vrlo sofisticiran i zahtijeva više rada nego PCR u stvarnom vremenu.
• Za razliku od PCR-a u stvarnom vremenu, konvencionalni PCR ne može razlikovati mrtve od živih bakterija.
• PCR u stvarnom vremenu koristi sustav fluorescentnih boja za otkrivanje proizvoda dok konvencionalni PCR koristi etidijev bromid i UV svjetlo za vizualizaciju traka u mediju agaroznog gela.
