Ključna razlika – NGS vs Sanger sekvenciranje
Sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) i Sangerovo sekvenciranje dvije su vrste tehnika sekvenciranja nukleotida koje su se razvile tijekom vremena. Sangerova metoda sekvenciranja bila je široko korištena dugi niz godina, a NGS ju je nedavno zamijenio zbog svojih prednosti. Ključna razlika između NGS i Sanger Sequencing je u tome što NGS radi na principu sekvenciranja milijuna sekvenci istovremeno na brz način kroz sustav sekvenciranja, dok Sanger Sequencing radi na principu prekidanja lanca zbog selektivne inkorporacije dideoksinukleotida pomoću enzima DNA polimeraze tijekom replikacije DNA i rezultirajućeg odvajanja fragmenata kapilarnom elektroforezom.
Što je sekvenciranje nukleotida?
Genetske informacije pohranjene su u nukleotidnim sekvencama DNK ili RNK organizma. Proces određivanja ispravnog redoslijeda nukleotida (koristeći četiri baze) u danom fragmentu (u genu, skupini gena, kromosomu i kompletnom genomu) poznat je kao sekvenciranje nukleotida. U genomskim studijama, forenzičkim studijama, virologiji, biološkoj sistematici, medicinskoj dijagnostici, biotehnologiji iu mnogim drugim područjima vrlo je važno analizirati strukturu i funkciju gena. Postoje različite vrste metoda sekvenciranja koje su razvili znanstvenici. Među njima, Sangerovo sekvenciranje koje je razvio Frederick Sanger 1977. bilo je široko korišteno i popularizirano dugo vremena dok ga nije zamijenilo sekvenciranje sljedeće generacije.
Što je NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) izraz je koji se koristi za označavanje modernih procesa sekvenciranja visoke propusnosti. Opisuje niz različitih modernih tehnologija sekvenciranja koje su revolucionirale genomske studije i molekularnu biologiju. Te tehnike su Illumina sekvenciranje, Roche 454 sekvenciranje, Ion Proton sekvenciranje i SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekvenciranje. NGS sustavi su brži i jeftiniji. Četiri glavne metode sekvencioniranja DNA koriste se u NGS sustavima, naime; pirosekvenciranje, sekvenciranje sintezom, sekvenciranje ligacijom i sekvenciranje ionskih poluvodiča. Veliki broj DNA ili RNA lanaca (milijuni) mogu se paralelno sekvencirati. Omogućuje sekvenciranje cijelog genoma organizama u kratkom vremenskom razdoblju, za razliku od Sanger sekvenciranja koje zahtijeva više vremena.
NGS ima mnogo prednosti u odnosu na konvencionalnu Sangerovu metodu sekvenciranja. To je brz, točniji i isplativiji proces koji se može izvesti s malom veličinom uzorka. NGS se može koristiti u metagenomskim studijama, u otkrivanju varijacija unutar individualnog genoma zbog umetanja i brisanja itd. te u analizi ekspresije gena.
Slika_1: Razvoj u NGS sekvenciranju
Što je Sanger sekvenciranje?
Sangerovo sekvenciranje je metoda sekvenciranja koju su razvili Frederick Sanger i njegovi kolege 1977. kako bi odredili točan redoslijed nukleotida danog fragmenta DNK. Također je poznato kao sekvenciranje prekida lanca ili dideoksi sekvenciranje. Princip rada ove metode je prekid sinteze lanca selektivnom ugradnjom dideoksinukleotida (ddNTP) koji završavaju lanac kao što su ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP pomoću DNA polimeraze tijekom replikacije DNA. Normalni nukleotidi imaju 3’ OH skupine za stvaranje fosfodiesterske veze između susjednih nukleotida za nastavak formiranja niti. Međutim, ddNTP-ovi nemaju ovu 3’ OH skupinu i ne mogu formirati fosfodiesterske veze između nukleotida. Dakle, produljenje lanca je prekinuto.
U ovoj metodi, jednolančana DNK koju treba sekvencirati služi kao predložak za in vitro sintezu DNK. Ostali zahtjevi su oligonukleotidna početnica, deoksinukleotidni prekursori i enzim DNA polimeraza. Kada su bočni krajevi ciljnog fragmenta poznati, početnice se mogu lako dizajnirati za replikaciju DNK. Četiri odvojene reakcije sinteze DNA izvode se u četiri odvojene epruvete. Svaka epruveta ima zasebne ddNTP-ove, zajedno s ostalim zahtjevima. Od određenog nukleotida dodaje se mješavina dNTP-a i ddNTP-a. Isto tako, četiri odvojene reakcije izvode se u četiri epruvete s četiri smjese. Nakon reakcija provodi se detekcija fragmenata DNA i konverzija uzorka fragmenta u informacije o sekvenci. Rezultirajući fragmenti DNA toplinski se denaturiraju i odvajaju elektroforezom u gelu. Ako se koriste radioaktivni nukleotidi, uzorak traka u poliakrilamidnom gelu može se vizualizirati autoradiografijom. Kada ova metoda koristi fluorescentno označene dideoksinukleotide, može se ublažiti očitavanjem gela i propustiti kroz zraku lasera kako bi je detektirao fluorescentni detektor. Kako bi se izbjegle pogreške koje bi mogle nastati kada se sekvenca čita okom i ručno unosi u računalo, ova se metoda razvila u korištenje automatiziranog sekvencera spojenog s računalom.
Ovo je metoda koja se koristi za sekvenciranje DNK iz projekta ljudskog genoma. Ova metoda se još uvijek koristi s naprednim modifikacijama jer daje točne informacije o nizu unatoč tome što je skup i spor proces.
Slika_2: Sanger sekvenciranje
Koja je razlika između NGS i Sanger sekvenciranja?
NGS vs Sanger sekvenciranje |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) odnosi se na moderne procese sekvenciranja visoke propusnosti. Opisuje niz različitih modernih tehnologija sekvenciranja | Sangerovo sekvenciranje je metoda sekvenciranja koju je razvio Frederick Sanger za određivanje preciznog redoslijeda nukleotida danog fragmenta DNK. |
| Isplativost | |
| NGS je jeftiniji proces jer smanjuje vrijeme, radnu snagu i kemikalije. | Ovo je skup proces jer zahtijeva vrijeme, ljudsku snagu i više kemikalija. |
| Brzina | |
| Ovo je brže jer se i kemijska detekcija i detekcija signala mnogih niti odvijaju paralelno. | Ovo oduzima puno vremena budući da se kemijska detekcija i detekcija signala odvijaju kao dva odvojena procesa i samo na cjedilu može se čitati odjednom. |
| Pouzdanost | |
| NGS je pouzdan. | Sangerovo sekvenciranje je manje pouzdano |
| Veličina uzorka | |
| NGS zahtijeva manje količine DNK. | Ova metoda zahtijeva veliku količinu predloška DNK. |
| DNK baze po sekvenciranom fragmentu | |
| Broj DNK baza po sekvenciranom fragmentu manji je od Sangerove metode | Generiranje sekvenci je duže od NGS sekvenci. |
Sažetak – NGS vs Sanger sekvenciranje
NGS i Sangerovo sekvenciranje su tehnike sekvenciranja nukleotida koje se intenzivno koriste u molekularnoj biologiji. Sangerovo sekvenciranje je rana metoda sekvenciranja koju je zamijenio NGS. Glavna razlika između NGS i Sanger sekvenciranja je u tome što je NGS brz, točniji i isplativiji proces od Sangerovog sekvenciranja. Obje tehnike stvorile su velike epidemije u genetici i biotehnologiji.
