Ključna razlika – Sanger sekvenciranje naspram pirosekvenciranja
DNK sekvenciranje je vrlo važno za DNK analizu budući da poznavanje ispravnog rasporeda nukleotida na određenoj DNK regiji otkriva mnoge važne informacije o njoj. Postoje različite metode sekvenciranja DNK. Sangerovo sekvenciranje i pirosekvenciranje dvije su različite metode sekvenciranja DNK koje se široko koriste u molekularnoj biologiji. Ključna razlika između Sangerovog sekvenciranja i pirosekvenciranja je u tome što Sangerovo sekvenciranje koristi dideoksinukleotide za prekid sinteze DNK za čitanje nukleotidnog slijeda, dok pirosekvenciranje otkriva otpuštanje pirofosfata ugradnjom nukleotida i sintetiziranjem komplementarnog slijeda za očitavanje preciznog redoslijeda slijeda.
Što je Sanger sekvenciranje?
Sangerovo sekvenciranje prva je generacija metode sekvenciranja DNK koju su razvili Frederick Sanger i njegovi kolegiji 1977. Također je poznato kao sekvenciranje prekida lanca ili dideoksi sekvenciranje jer se temelji na prekidanju lanca pomoću dideoksinukleotida (ddNTP). Ova metoda bila je naširoko korištena više od 30 godina dok nije razvijena Nova generacija sekvenciranja (NGS). Sangerova tehnika sekvenciranja omogućila je otkrivanje ispravnog redoslijeda nukleotida ili pričvršćivanje određenog fragmenta DNA. Temelji se na selektivnoj ugradnji ddNTP-a i prekidanju sinteze DNA tijekom in vitro replikacije DNA. Odsutnost 3’ OH skupina za nastavak stvaranja fosfodiesterskih veza između susjednih nukleotida jedinstvena je značajka ddNTP-a. Dakle, jednom kada je ddNTP pričvršćen, produljenje lanca prestaje i završava od te točke. Postoje četiri ddNTP-a – ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP – koji se koriste u Sangerovom sekvenciranju. Ovi nukleotidi zaustavljaju proces replikacije DNK kada se ugrade u rastući lanac DNK i rezultiraju različitim duljinama kratke DNK. Kapilarna gel elektroforeza koristi se za organiziranje ovih kratkih DNK lanaca prema njihovoj veličini na gelu kao što je prikazano na slici 01.
Slika 1: Kapilarna gel elektroforeza sintetizirane kratke DNA
Za in vitro replikaciju DNK, treba osigurati nekoliko zahtjeva. Oni su enzim DNA polimeraza, šablonska DNA, oligonukleotidni početnici i deoksinukleotidi (dNTP). U Sangerovom sekvenciranju, replikacija DNK izvodi se u četiri odvojene epruvete zajedno s četiri vrste ddNTP-a zasebno. Deoksinukleotidi nisu u potpunosti zamijenjeni odgovarajućim ddNTP-ima. Mješavina određenog dNTP-a (na primjer; dATP + ddATP) uključena je u epruvetu i replicirana. Četiri odvojena proizvoda iz epruvete su testirana na gelu u četiri odvojene jažice. Zatim se očitavanjem gela sekvenca može konstruirati kao što je prikazano na slici 02.
Slika 02: Sangerovo sekvenciranje
Sangerovo sekvenciranje je važna tehnika koja pomaže u mnogim područjima molekularne biologije. Projekt ljudskog genoma uspješno je dovršen uz pomoć Sangerovih metoda sekvenciranja. Sangerovo sekvenciranje također je korisno u sekvencioniranju ciljne DNK, istraživanju raka i genetskih bolesti, analizi ekspresije gena, ljudskoj identifikaciji, otkrivanju patogena, mikrobnom sekvencioniranju itd.
Postoji nekoliko nedostataka Sangerovog sekvenciranja:
- Duljina DNK koja se sekvencira ne može biti duža od 1000 parova baza
- Možete sekvencirati samo jednu nit odjednom.
- Proces je dugotrajan i skup.
Stoga su s vremenom razvijene nove napredne tehnike sekvenciranja kako bi se prevladali ovi problemi. Međutim, Sangerovo sekvenciranje još uvijek je u upotrebi zbog vrlo preciznih rezultata do otprilike 850 fragmenata duljine parova baza.
Što je pirosekvenciranje?
Pyrosquencing je nova tehnika sekvenciranja DNA koja se temelji na "sekvenciranju sintezom". Ova se tehnika oslanja na detekciju otpuštanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida. Proces koriste četiri različita enzima: DNA polimera, ATP sulfurilaza, luciferaza i apiraza i dva supstrata adenozin 5’ fosfosulfat (APS) i luciferin.
Proces počinje vezanjem početnice s jednolančanom DNA šablonom i DNA polimeraza započinje ugradnju nukleotida koji su joj komplementarni. Kada se nukleotidi spoje (polimerizacija nukleinske kiseline), oslobađaju se pirofosfatne (dvije fosfatne skupine povezane zajedno) skupine i energija. Svaki dodatak nukleotida oslobađa ekvimolarnu količinu pirofosfata. Pirofosfat se pretvara u ATP pomoću ATP sulfurilaze u prisutnosti supstrata APS. Generirani ATP pokreće pretvorbu luciferina u oksiluciferin posredovanu luciferazom, proizvodeći vidljivu svjetlost u količinama koje su proporcionalne količini ATP-a. Svjetlo detektira uređaj za detekciju fotona ili fotomultiplikator i stvara pirogram. Apiraza razgrađuje ATP i neinkorporirane dNTP u reakcijskoj smjesi. Dodavanje dNTP-a vrši se jednom po jednom. Budući da je dodavanje nukleotida poznato prema ugradnji i detekciji svjetla, može se odrediti slijed predloška. Pirogram se koristi za generiranje nukleotidnog niza DNK uzorka kao što je prikazano na slici 03.
Pirosekvenciranje je vrlo važno u analizi polimorfizma jednog nukleotida i sekvenciranja kratkih dionica DNA. Visoka točnost, fleksibilnost, jednostavnost automatizacije i paralelna obrada prednosti su pirosekvenciranja u odnosu na Sangerove tehnike sekvenciranja.
Slika 03: Pirosekvenciranje
Koja je razlika između Sanger sekvenciranja i pirosekvenciranja?
Sangerovo sekvenciranje nasuprot pirosekvenciranja |
|
| Sangerovo sekvenciranje je metoda sekvencioniranja DNA koja se temelji na selektivnoj inkorporaciji ddNTP-a pomoću DNA polimeraze i terminaciji lanca. | Pirosekvenciranje je metoda sekvenciranja DNK koja se temelji na detekciji otpuštanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida. |
| Upotreba ddNTP | |
| ddNTP se koriste za prekid replikacije DNK | ddNTP se ne koriste. |
| Uključeni enzimi | |
| Koriste se DNA polimeraze. | Koriste se četiri enzima: DNA polimeraza, ATP sulfurilaza, luciferaza i apiraza. |
| Upotrijebljeni supstrati | |
| APS i Luciferin se ne koriste. | Koriste se adenozin 5’ fosfosulfat (APS) i luciferin. |
| Maksimalna temperatura | |
| Ovo je spor proces. | Ovo je brz proces. |
Sažetak – Sangerovo sekvenciranje nasuprot pirosekvenciranja
Sangerovo sekvenciranje i pirosekvenciranje dvije su metode sekvenciranja DNK koje se koriste u molekularnoj biologiji. Sangerovo sekvenciranje konstruira redoslijed nukleotida u nizu prekidanjem produljenja lanca, dok pirosekvenciranje konstruira precizan redoslijed nukleotida u nizu ugradnjom nukleotida i otkrivanjem otpuštanja pirofosfata. Stoga je glavna razlika između Sangerovog sekvenciranja i pirosekvenciranja u tome što Sangerovo sekvenciranje radi na sekvenciranju prekidanjem lanca, dok pirosekvenciranje radi na sekvenciranju sintezom.
