Ključna razlika – PCR naspram sekvenciranja DNK
PCR i DNA sekvenciranje dvije su važne tehnike u molekularnoj biologiji. Lančana reakcija polimerazom (PCR) je proces koji stvara veliki broj kopija fragmenta DNK. Sekvenciranje DNA je tehnika koja rezultira preciznim redoslijedom nukleotida danog fragmenta DNA. Ovo je ključna razlika između PCR-a i DNA sekvenciranja. PCR je jedan od glavnih koraka uključenih u sekvenciranje DNK.
Što je PCR?
Lančana reakcija polimerazom (PCR) je tehnika umnožavanja DNK koja se koristi u molekularnoj biologiji. Proizvodi tisuće do milijune kopija određenog fragmenta DNK. Ovu je metodu razvio Kary Mullis 1983. U ovoj tehnici, fragment DNK koji treba umnožiti služi kao predložak, a enzim DNK polimeraza dodaje komplementarne nukleotide u početnicu koja je dostupna u PCR smjesi. Na kraju PCR reakcije sintetiziraju se mnoge kopije DNK uzorka.
Postoje različite komponente PCR mješavine, uključujući DNA, DNA polimerazu (Taq polimeraza), početnice (ispravne i obrnute početnice), nukleotide (građevne jedinice DNK) i pufer. PCR se događa unutar PCR stroja, a ispravnu PCR smjesu treba učitati u stroj i treba pokrenuti ispravan program. Ova tehnika omogućuje proizvodnju tisuća do milijuna kopija određenog dijela DNK iz vrlo male količine DNK.
PCR reakcije odvijaju se ciklički kako bi proizvele vidljivu količinu PCR proizvoda na gelu. Tri su glavna koraka uključena u PCR reakciju, a to su denaturacija, žarenje primera i produženje niti kao što je prikazano na slici 01. Ova tri koraka odvijaju se na tri različite temperature. DNK postoji u dvostrukom lančanom obliku pomoću vodikovih veza između komplementarnih baza. Prije implikacije, dvolančane DNK treba odvojiti jedna od druge. Radi se davanjem visoke temperature. Na visokoj temperaturi, dvolančana DNA denaturira u jednostruke niti. Zatim bi se početnice trebale približiti bočnim krajevima specifičnog fragmenta ili gena DNK. Primer je kratki komadić jednolančane DNK koji je komplementaran ciljnom nizu. Prednji i obrnuti primeri žare se s komplementarnim bazama na bočnim krajevima denaturiranog uzorka DNA na temperaturi žarenja. Primeri moraju biti otporni na toplinu. Nakon što se početnice spoje s DNK uzorka, enzim taq polimeraza započinje sintezu novih niti dodavanjem nukleotida koji su komplementarni ciljnoj DNK. Taq polimeraza je toplinski stabilan enzim izoliran iz termofilne bakterije nazvane Thermus aquaticus. PCR pufer održava optimalne uvjete za djelovanje taq polimeraze. Ove tri faze PCR reakcija se ponavljaju kako bi se proizvela potrebna količina PCR proizvoda. Nakon svake PCR reakcije broj DNK kopija se udvostručuje. Stoga se u PCR-u može uočiti eksponencijalno pojačanje. PCR proizvodi se mogu promatrati pomoću gel elektroforeze i mogu se pročistiti za daljnja istraživanja.
Slika 01: Glavni koraci PCR reakcije
PCR je vrijedan alat u medicinskim i biološkim istraživanjima. PCR ima posebnu vrijednost u forenzičkoj znanosti budući da može umnožiti DNK za studije iz sićušnih uzoraka kriminalaca i napraviti forenzičke DNK profile. PCR se naširoko koristi u mnogim područjima molekularne biologije uključujući genotipizaciju, kloniranje gena, detekciju mutacija, sekvenciranje DNK, DNK mikronizove i testiranje očinstva, itd.
Slika 02: Lančana reakcija polimeraze
Što je sekvenciranje DNK?
DNA sekvenciranje je određivanje preciznog redoslijeda nukleotida – adenina, gvanina, citozina i timina u danom fragmentu DNA. Genetske informacije pohranjuju se u sekvence DNK koristeći točan redoslijed nukleotida. Stoga je pronalaženje preciznog redoslijeda nukleotida u fragmentu DNA vrlo važno za poznavanje strukture i funkcije gena.
Protokol sekvenciranja DNK uključuje različite procese. Prvi korak je izolacija zainteresirane DNA ili genomske DNA organizma. Koristeći PCR (kao što je gore opisano), potrebno je umnožiti željenu regiju DNA. Umnoženi PCR produkt treba odvojiti gel elektroforezom i pročistiti. Amplificirani fragmenti služe kao predlošci za sekvenciranje. Sekvenciranje se može izvršiti prema Sangerovom sekvenciranju ili metodi sekvenciranja visoke propusnosti. Sangerovo sekvenciranje zahtijeva kapilarnu elektroforezu rezultirajućih fragmenata DNA. Određivanje ispravnog redoslijeda nukleotida može se izvršiti ručnim očitavanjem autoradiografa ili korištenjem automatiziranih DNA sekvencera.
Sekvenciranje gena doprinijelo je projektu ljudskog genoma i olakšalo mapiranje ljudskog genoma 2003. U forenzici, sekvenciranje DNK omogućilo je identifikaciju pojedinaca koji pokazuju jedinstvene sekvence DNK i identificiraju kriminalce. U medicini se sekvencioniranje DNK može koristiti za otkrivanje gena odgovornih za genetske i druge bolesti, pronalaženje neispravnih gena i njihovu zamjenu ispravnim genima. U poljoprivredi se informacije o sekvenciranju DNK nekih mikroorganizama koriste za proizvodnju transgenih usjeva s ekonomski željenim karakteristikama.
Slika 03: Sekvenciranje DNK
Koja je razlika između PCR i DNA sekvenciranja?
PCR vs sekvenciranje DNA |
|
| PCR proces stvara tisuće do milijune kopija željenog fragmenta DNK. | DNA sekvenciranje je proces određivanja preciznog redoslijeda nukleotida u određenom DNA fragmentu. |
| Ishod | |
| PCR stvara tisuće do milijune kopija određenog fragmenta DNK | Ovo rezultira ispravnim redoslijedom baza u određenom fragmentu DNK. |
| Uključenost ddNTP-ova | |
| PCR ne zahtijeva ddNTP. Koristi dNTP-ove. | DNK sekvencioniranje zahtijeva ddNTP za prekid formiranja lanca. |
Sažetak – PCR nasuprot DNK sekvencioniranju
PCR i sekvenciranje DNA vrlo su važni alati u mnogim područjima molekularne biologije. Umnožavanje fragmenata DNA vrši se PCR tehnikom, dok se točan redoslijed nukleotida fragmenta DNA utvrđuje sekvenciranjem DNA. Ovo je razlika između PCR i DNA sekvenciranja.
