Ključna razlika – Microarray vs RNA sekvenciranje
Transkriptom predstavlja cjelokupni sadržaj RNK prisutne u stanici uključujući mRNA, rRNA, tRNA, degradiranu RNK i nerazgrađenu RNK. Profiliranje transkriptoma važan je proces za razumijevanje uvida u stanicu. Postoji nekoliko naprednih metoda za profiliranje transkriptoma. Microarray i RNA sekvenciranje dvije su vrste tehnologija razvijene za analizu transkriptoma. Ključna razlika između sekvenciranja mikronizova i RNA je u tome što se mikronizovi temelje na hibridizacijskom potencijalu unaprijed dizajniranih obilježenih sondi s ciljnim cDNA sekvencama, dok se sekvenciranje RNA temelji na izravnom sekvenciranju cDNA lanaca naprednim tehnikama sekvenciranja kao što je NGS. Microarray se izvodi s prethodnim znanjem o sekvencama, a RNA sekvenciranje se izvodi bez prethodnog znanja o sekvencama.
Što je Microarray?
Microarray je robusna, pouzdana i visoko propusna metoda koju znanstvenici koriste za profiliranje transkriptoma. To je najpopularniji pristup za analizu prijepisa. To je jeftina metoda, koja ovisi o hibridizacijskim sondama.
Tehnika počinje ekstrakcijom mRNA iz uzorka i konstrukcijom cDNA biblioteke iz ukupne RNA. Zatim se miješa s fluorescentno obilježenim unaprijed dizajniranim sondama na čvrstoj površini (spot matrix). Komplementarne sekvence se hibridiziraju s obilježenim probama u mikronizu. Zatim se mikromreža ispere i pregleda, a slika se kvantificira. Prikupljene podatke treba analizirati kako bi se dobili profili relativnih izraza.
Pretpostavlja se da je intenzitet sondi mikronizova proporcionalan količini transkripata u uzorku. Međutim, točnost tehnike ovisi o dizajniranim sondama, prethodnom poznavanju sekvence i afinitetu sondi za hibridizaciju. Stoga tehnologija mikronizova ima ograničenja. Tehnika mikromreža ne može se izvesti s transkriptima male količine. Ne uspijeva razlikovati izoforme i identificirati genetske varijante. Budući da ova metoda ovisi o hibridizaciji sondi, neki problemi povezani s hibridizacijom kao što su unakrsna hibridizacija, nespecifična hibridizacija itd. javljaju se u tehnici mikronizova.
Slika 01: Mikroniz
Što je RNA sekvenciranje?
RNA shotgun sekvenciranje (RNA seq) nedavno je razvijena tehnika sekvenciranja cijelog transkriptoma. To je brza i propusna metoda profiliranja transkriptoma. Izravno kvantificira ekspresiju gena i rezultira dubokim istraživanjem transkriptoma. RNA seq ne ovisi o unaprijed dizajniranim probama ili prethodnom znanju o sekvencama. Stoga RNA seq metoda ima visoku osjetljivost i sposobnost otkrivanja novih gena i genetskih varijanti.
Metoda sekvenciranja RNA provodi se kroz nekoliko koraka. Ukupna RNA stanice mora biti izolirana i fragmentirana. Zatim se pomoću reverzne transkriptaze mora pripremiti biblioteka cDNA. Svaki lanac cDNA mora biti povezan s adapterima. Zatim se povezani fragmenti moraju amplificirati i pročistiti. Na kraju, korištenjem NGS metode, mora se izvršiti sekvencioniranje cDNA.
Slika 02: Sekvenciranje RNA
Koja je razlika između Microarray i RNA sekvenciranja?
Mikroniz protiv sekvenciranja RNA |
|
| Microarray je robusna, pouzdana metoda visoke propusnosti. | RNK sekvenciranje je precizna i visokoučinkovita metoda. |
| Cost | |
| Ovo je jeftina metoda. | Ovo je skupa metoda. |
| Analiza velikog broja uzoraka | |
| Ovo olakšava analizu velikog broja uzoraka istovremeno. | Ovo olakšava analizu velikog broja uzoraka. |
| Analiza podataka | |
| Analiza podataka je složena. | Ovom metodom generira se više podataka; stoga je proces složeniji. |
| Prethodno poznavanje nizova | |
| Ova se metoda temelji na hibridizacijskim probama, stoga je potrebno prethodno znanje o sekvencama. | Ova metoda ne ovisi o prethodnom znanju slijeda. |
| Strukturne varijacije i novi geni | |
| Ova metoda ne može otkriti strukturne varijacije i nove gene. | Ova metoda može otkriti strukturne varijacije kao što su spajanje gena, alternativno spajanje i novi geni. |
| Osjetljivost | |
| Ovo ne može otkriti razlike u ekspresiji izoformi, tako da ima ograničenu osjetljivost. | Ovo ima visoku osjetljivost. |
| Ishod | |
| Ovo može rezultirati samo relativnim razinama izražaja. Ovo ne daje apsolutnu kvantifikaciju ekspresije gena. | Daje apsolutne i relativne razine izražavanja. |
| Ponovna analiza podataka | |
| Ovo treba ponovno pokrenuti kako bi se ponovno analiziralo. | Podaci sekvenciranja mogu se ponovno analizirati. |
| Potreba za određenim osobljem i infrastrukturom | |
| Specifična infrastruktura i osoblje nisu potrebni za microarray. | Specifična infrastruktura i osoblje potrebno za sekvenciranje RNA. |
| Tehnički problemi | |
| Tehnika mikronizova ima tehničke probleme kao što su unakrsna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, ograničena stopa detekcije pojedinačnih sondi, itd. | Tehnika RNA seq izbjegava tehničke probleme kao što su križna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, ograničena stopa detekcije pojedinačnih sondi, itd. |
| Pristranosti | |
| Ovo je pristrana metoda jer ovisi o hibridizaciji. | Pristranost je niska u usporedbi s mikromrežom. |
Sažetak – Microarray vs RNA sekvenciranje
Metode sekvenciranja mikronizova i RNA platforme su visoke propusnosti razvijene za profiliranje transkriptoma. Obje metode daju rezultate koji su u visokoj korelaciji s profilima ekspresije gena. Međutim, sekvenciranje RNA ima prednosti u odnosu na mikronizove za analizu ekspresije gena. Sekvencioniranje RNA je osjetljivija metoda za detekciju transkripata niske abundacije od mikronizova. Sekvenciranje RNA također omogućuje razlikovanje izoformi i identifikaciju varijanti gena. Međutim, mikronizovi su uobičajeni izbor većine istraživača budući da je sekvenciranje RNA nova i skupa tehnika s izazovima pohranjivanja podataka i složenom analizom podataka.
