Ključna razlika – SDS stranica u odnosu na Western Blot
Western blotting je tehnika koja otkriva specifičan protein iz uzorka proteina. Ova tehnika se izvodi kroz nekoliko ključnih koraka: gel elektroforeza, blotiranje i hibridizacija. Elektroforeza u poliakrilamidnom gelu s natrijevim dodecil sulfatom (SDS stranica) vrsta je tehnike elektroforeze u gelu koja se koristi za odvajanje proteina prema njihovoj veličini (molekularnoj težini). Western blot je poseban list membrane za upijanje koji se koristi za prijenos istog uzorka proteina u SDS stranicu. Ključna razlika između SDS stranice i western blota je u tome što SDS stranica omogućuje odvajanje proteina u smjesi dok western blot omogućuje detekciju i kvantifikaciju specifičnog proteina iz smjese. Oba su korisna u studijama analize proteina.
Što je SDS stranica?
SDS Page je tehnika gel elektroforeze koja se koristi za odvajanje proteina. Obično se koristi u biokemiji, genetici, forenzici i molekularnoj biologiji. Nakon što se proteini ekstrahiraju iz uzorka, stavljaju se na gel koji se sastoji od SDS-a i poliakrilamida. SDS je anionski deterdžent koji se koristi za linearizaciju proteina (denaturaciju proteina) i davanje negativnog naboja lineariziranim proteinima proporcionalno njihovoj molekularnoj masi. Poliakrilamid postaje čvrsta potpora za gel. Denaturirani proteini koji su negativno nabijeni migriraju prema pozitivnom kraju aparata kroz gel. Ovisno o veličini proteina, brzine migracije razlikuju se između proteina i dolazi do odvajanja. Stoga je SDS stranica korisna za odvajanje pojedinačnih proteina na temelju njihove veličine.
Priprema poliakrilamidnog gela za frakcioniranje proteina ključni je korak u SDS stranici. Točna koncentracija poliakrilamida i vrsta korištenog sredstva za umrežavanje snažno utječu na fizička svojstva gela, što čini stvarno odvajanje različitih proteina. Za učinkovito odvajanje potrebno je pravilno upravljati veličinom pora gela. Međutim, SDS stranica se smatra tehnikom odvajanja proteina visoke rezolucije.
SDS Page tehnika ima veliko ograničenje u analizi proteina. Budući da SDS denaturira proteine prije odvajanja, ne dopušta otkrivanje enzimske aktivnosti, interakcija vezanja proteina, proteinskih kofaktora, itd.
Slika 01: SDS stranica
Što je Western Blot?
Western blotting tehnika omogućuje detekciju specifičnog proteina iz proteinske smjese te mjerenje količine i molekularne težine proteina. Western blot je membrana koja se koristi tijekom postupka blotiranja kako bi se dobila zrcalna slika proteinskih uzoraka u SDS-poliakrilamidnom gelu. Membrana koja se koristi za Western blotting uglavnom se sastoji od nitroceluloze ili poliviniliden difluorida (PVDF). Membrana s prenesenim proteinom može se koristiti za identifikaciju željenog proteina. Za detekciju željenog proteina hibridizacijom potrebna su visokokvalitetna antitijela. Antitijelo se veže za svoj specifični antigen i otkriva prisutnost željenog antigena koji je protein.
Prijenos proteina iz SDS poliakrilamidnog gela u western blot izvodi se elektroblotiranjem. To je učinkovita i brza metoda koja uzrokuje da proteini elektroforezom izlaze iz gela i prelaze na nitroceluloznu membranu (western blot).
Slika 02: Western Blot
Koja je razlika između SDS stranice i Western Blota?
SDS stranica vs Western Blot |
|
| SDS Stranica je tehnika gel elektroforeze. | Western blot je tehnika koja se izvodi na membrani za otkrivanje specifičnog proteina iz smjese. |
| Koristi | |
| SDS stranica omogućuje odvajanje proteina prema njihovoj veličini. | Western blot omogućuje prijenos proteina na SDS page gelu bez promjene njegovog uzorka i omogućuje hibridizaciju sa specifičnim antitijelima. |
| Nedostaci | |
| Denaturacija proteina, visoka cijena i prisutnost neurotoksinskih kemikalija su nedostaci ove tehnike. | Ova tehnika je dugotrajna i zahtijeva dobro osobno iskustvo i specifične kontrolirane uvjete. |
Sažetak – SDS stranica u odnosu na Western Blot
SDS stranica i western blot dvije su metode uključene u analizu proteina. SDS stranica omogućuje jednostavno odvajanje proteina na gelu prema njihovoj molekularnoj težini. Western blot pomaže potvrditi prisutnost i količinu specifičnog proteina kroz hibridizaciju sa specifičnim antitijelima. Ovo je razlika između SDS stranice i western blota.
