Ključna razlika – SDS stranica naspram izvorne stranice
SDS i matična stranica dvije su vrste tehnika elektroforeze u poliakrilamidnom gelu koje se koriste u molekularnoj biologiji. Ključna razlika između SDS Page i Native Page je vrsta poliakrilamidnog gela koji se koristi. U SDS stranici se koristi denaturirajući gel, stoga se molekule odvajaju na temelju njihove molekularne težine. Nasuprot tome, u Native Pageu koriste se nedenaturirajući gelovi. Stoga se molekule odvajaju na temelju njihove veličine, naboja i oblika.
Poliakrilamidna gel elektroforeza (Page) koristi gel napravljen polimerizacijom akrilamidnih monomera s metilen bisakrilamidom. Poliakrilamid je čvršći i toplinski stabilniji od agaroze. Poliakrilamidni gelovi imaju manju veličinu pora što omogućuje učinkovito odvajanje proteina. Postoje dvije glavne vrste postavki stranice, naime SDS stranica i izvorna stranica. SDS Page ili elektroforeza natrijevog dodecil sulfata u poliakrilamidnom gelu razdvaja proteine na temelju njihove molekularne težine. U SDS stranici koriste se denaturirajući gelovi. Native Page koristi gelove koji ne denaturiraju i odvaja proteine na temelju njihove veličine, naboja i oblika (3D konformacije).
Što je SDS stranica?
SDS Page je najčešća elektroforetska tehnika koja se koristi za odvajanje proteina na temelju njihove molekularne težine. Gel se dobiva dodavanjem SDS (Sodium dodecyl sulfate), koji je deterdžent. SDS pretvara proteine u monomere. SDS je anionski deterdžent. Stoga dodaje neto negativni naboj proteinima unutar širokog pH raspona. Kada se neto negativni naboj prenese na proteinske molekule, zbog varijacije naboja, složene strukture se razgrađuju. Zbog negativnog naboja, proteini se privlače prema pozitivnom kraju. Stoga molekule s nižom molekularnom težinom putuju brže po matrici gela i mogu se promatrati blizu anode, dok se proteini s većom molekularnom težinom promatraju bliže jažicama.
Slika 01: SDS stranica
SDS vezanje na polipeptidni lanac proporcionalno je njegovoj relativnoj molekularnoj masi. Stoga se molekularna masa također može odrediti putem SDS stranice. Bojanje SDS Page gelova vrši se bojenjem bromofenol plavim. Primjena SDS stranice u većem je opsegu tamo gdje se može koristiti za procjenu relativne molekularne mase i za određivanje relativnog udjela proteina u mješavini proteina. SDS Page se također može koristiti za određivanje distribucije proteina u mješavini proteina. SDS stranica također se primjenjuje za pročišćavanje i procjenu proteina. Koristi se kao preliminarni postupak za Western blotting i hibridizaciju, koji se zauzvrat koristi za mapiranje i identifikaciju proteina.
Što je izvorna stranica?
Nativna elektroforeza s poliakrilamidnim gelom (Native Page) koristi gel koji ne denaturira. Stoga se SDS ili bilo koji drugi denaturirajući agens ne dodaje u matricu gela. U Native Pageu, odvajanje proteina temelji se na naboju i veličini proteina. Stoga pokretljivost proteina ovisi o naboju i veličini proteina.
Naboj proteina ovisi o bočnim lancima aminokiselina. Ako su bočni lanci negativno nabijeni, protein će dobiti ukupni negativni naboj i obrnuto. Proteini zadržavaju 3D konformaciju zbog savijanja koje se odvija. Savijanje je rezultat nekoliko tipova veza u proteinima kao što su disulfidne veze, hidrofobne interakcije i vodikove veze. Stoga, ako se nativni Page nosi pri neutralnom pH, proteini će biti odvojeni prema molekularnom obliku proteina. Stoga se izvorna stranica može koristiti kao osjetljiva tehnika za otkrivanje promjene naboja ili konformacije proteina.
Glavna prednost izvornog Page-a je da se protein koji se koristi za Page-analizu može povratiti u svoje izvorno stanje nakon Page-analize, budući da se protein ne ometa tijekom procesa. Izvorna stranica je tehnika relativno visoke propusnosti, a stabilnost proteina je povećana.
Slika 02: Izvorna stranica
Nakon završetka ciklusa gela, gel Native Page se može vidjeti bojenjem bromofenol plavim ili bilo kojim drugim prikladnim reagensom za bojenje. Primjena Native Page uključuje odvajanje kiselih proteina uključujući glikoproteine kao što je ljudski rekombinantni eritropoetin ili identifikaciju proteina prisutnih u goveđem serumskom albuminu (BSA).
Koje su sličnosti između SDS stranice i izvorne stranice?
- I SDS Page i Native Page sustavi koriste poliakrilamidni gel kao matricu gela.
- Oboje se koristi za odvajanje i identifikaciju proteina.
- Oboje koriste elektroforetsku pokretljivost za odvajanje spojeva.
- Oboje se može izvesti na okomiti ili vodoravni način (uglavnom se radi kao okomita postavka stranice jer je duljina izvođenja veća).
- Aparat za elektroforezu uključujući spremnik gela, češljeve, napajanje je potreban za rad obje tehnike.
- Vizualizaciju gela moguće je napraviti metodama bojenja u obje tehnike.
Koja je razlika između SDS stranice i izvorne stranice?
SDS stranica u odnosu na izvornu stranicu |
|
| SDS Page ili Stranica s natrijevim dodecil sulfatom odvaja proteine na temelju njihove molekularne težine i koristi denaturirajući gel. | Native Page koristi gelove koji ne denaturiraju i odvaja proteine na temelju njihove veličine, naboja i oblika (3D konformacije). |
| Vrsta gela | |
| Denaturirajući gel koristi se u SDS-stranici. | Na matičnoj stranici koristi se gel koji ne denaturira. |
| Prisutnost SDS-a | |
| SDS je prisutan kao deterdžent za stvaranje negativnog naboja na uzorku na SDS stranici. | SDS nije prisutan na matičnoj stranici. |
| Osnova razdvajanja | |
| Razdvajanje proteina ovisi o molekularnoj težini proteina na SDS stranici. | Razdvajanje ovisi o veličini i obliku proteinske molekule u matičnoj stranici. |
| Stabilnost proteina | |
| Stabilnost proteina je niska u SDS stranici. | Stabilnost proteina je visoka na matičnoj stranici. |
| Oporavak originalnog proteina | |
| Nije moguće jer je denaturirano na SDS stranici. | Moguće na matičnoj stranici. |
Sažetak – SDS stranica u odnosu na izvornu stranicu
SDS Page i Native Page dvije su vrste tehnika elektroforeze u poliakrilamidnom gelu koje se koriste za odvajanje proteina. SDS stranica se tretira deterdžentom koji se zove SDS. SDS daje ukupni negativni naboj proteinu, što zatim rezultira denaturacijom proteina. Stoga se proteini odvajaju na temelju njihove molekularne težine. Nasuprot tome, tehnika izvorne stranice ne koristi sredstvo za denaturaciju. Tako se proteini odvajaju na temelju njihove veličine ili oblika. Ovo je razlika između SDS stranice i izvorne stranice.
