Ključna razlika – PCR primeri u odnosu na primere za sekvenciranje
S nedavnim razvojem na polju molekularne biologije, razvijene su različite genetske tehnike koje su procese istraživanja različitih aspekata subjekta učinile lakim i točnim. PCR i drugi postupci sekvenciranja dvije su važne takve tehnike. Koriste različite podkomponente. Primeri se smatraju glavnom podkomponentom zajedničkom za PCR i tehnike sekvenciranja. PCR početnice koriste se za umnožavanje određenog slijeda DNA, dok se početnice za sekvenciranje koriste u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNA s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog reda nukleotidnog slijeda. Ovo je ključna razlika između PCR početnica i početnica za sekvenciranje.
Što su PCR Primeri?
Lančana reakcija polimeraze (PCR) je genetska tehnika koja se koristi u području molekularne biologije kako bi se umnožila jedna ili nekoliko kopija određenog segmenta DNK i kako bi se dobili mnogi milijuni identičnih kopija. U PCR reakciji koriste se različite komponente uključujući početnice. Primeri su kratki lanci DNA s duljinom nukleotida od 18-25 što ih čini kompatibilnima s početnim i krajnjim područjem fragmenata DNA koje treba umnožiti. Primeri mogu biti početni i obrnuti početni. Ti se početnici vežu za DNA fragment na određenim točkama gdje tjeraju DNA polimerazu da se veže za specifični primer na mjestu i započne sintezu novog DNA lanca.
Odabir početnica važan je aspekt PCR procesa. Važan je odabir duljine temeljnog premaza. Idealna duljina bila bi 18-25 nukleotida. Ako je duljina prekratka ili preduga, početnice se neće vezati na sekvencu DNK da bi se točno umnožile. Primeri koji su prekratki dovode do nespecifičnog žarenja primera na različitim mjestima sekvence DNK.
Slika 01: PCR primeri
Sadržaj gvanina i citozina (GC) u dobrom primeru trebao bi biti u rasponu od 40-60. Temperatura žarenja primera i temperatura taljenja vitalni su čimbenici tijekom PCR-a. Temperaturu taljenja treba točno izračunati, a temperatura žarenja temeljnog premaza treba biti 5 0C niža od temperature taljenja. Temperatura topljenja treba biti 60 °C i 75 °C. Previsoke ili preniske temperature rezultirat će manje aktivnom aktivnošću DNA polimeraze.
Što su Primeri za sekvenciranje?
Primeri za sekvenciranje koriste se u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog identiteta. Za postizanje dobrih rezultata sekvenciranja važni su visokokvalitetni primeri i predlošci. Stoga, kada se odabiru početnice, one bi trebale biti jedinstvene za određenu regiju u kojoj želimo sekvencirati. Također bi trebao biti s ispravnom orijentacijom gdje se sekvence obično generiraju od 3' do 5' krajeva početnica. U nizu bi trebala nedostajati neželjena samohibridizacija kao što je formiranje ukosnih petlji. Ne smije sadržavati uzastopno stvaranje gvaninskih baza.
Temperatura taljenja (Tm) primera mora biti prikladna za uvjete sekvenciranja. Stoga bi trebao biti između 52oC i 74oC. Pripravak oligonukleotida koji će se koristiti kao početnica treba se pročistiti kako bi se dobila željena puna duljina sekvence. Ako oligonukleotidi sadrže nečistoće, signalizacija slijeda početnica će se superponirati s različitih početnih mjesta, a također će smanjiti broj baznih stanica.
Slika 02: Prajmeri za sekvenciranje
Temperatura taljenja početnice (Tm) oligonukleotida određuje koliko su jaki komplementarni DNA lanci međusobno hibridizirani. Tm se može smatrati termodinamičkim izračunom gdje ovisi o sekvencama DNK i nekoliko uvjeta kao što je koncentracija soli. Tm je važan tijekom PCR-a gdje se koristi varijanta koja se naziva sekvenciranje ciklusa za proizvodnju skupine fragmenata s dideoksinukleotidnim završetkom. Ovdje će početnica koja je sekvencionirana prvo biti alternativno žarena, zatim produžena i na kraju denaturirana za pojačanje. Stoga bi vrijednost Tm trebala biti između 52oC i 74o C. Sintetizirani oligonukleotidi mogu se nabaviti u laboratorijima za sintezu DNA/RNA prema izbor. Mala ljestvica sinteze koja se koristi za sekvenciranje DNK obično je 50 nmol. Također, što je najvažnije, početnice koje se koriste za sekvenciranje trebaju biti pročišćene da ne sadrže nečistoće koje će spriječiti smanjenje kvalitete.
Koje su sličnosti između PCR početnica i početnica za sekvenciranje?
- I PCR Primeri i Primeri za sekvenciranje su primeri koji se koriste u procesu amplifikacije ciljane sekvence DNK.
- I PCR početnici i početnici za sekvenciranje sastoje se od nukleotida.
- I PCR Primeri i Primeri za sekvenciranje kratki su oligomeri.
Koja je razlika između PCR početnica i početnica za sekvenciranje?
PCR Primeri vs Primeri za sekvenciranje |
|
| PCR početnice su kratki DNA lanci s duljinom nukleotidne sekvence od 18-25 što ih čini kompatibilnim s početnim i krajnjim područjem DNA fragmenata koji se umnožavaju. | Primeri za sekvenciranje kratki su oligomeri koji se koriste u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog identiteta. |
| Funkcija | |
| PCR početnice koriste se za umnožavanje određene DNA sekvence. | Primeri za sekvenciranje koriste se u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog identiteta. |
| Potreban broj primera | |
| Dva primera; jedan prednji početni i jedan reverzni početni se koriste kao PCR početnice. | Potreban je samo jedan primer kao početnica za sekvenciranje. |
Sažetak – PCR Primeri u odnosu na Primere za sekvenciranje
Primeri za sekvenciranje koriste se u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog identiteta. Jedan primer za sekvenciranje bit će dovoljan za pokretanje procesa. Za postizanje dobrih rezultata sekvenciranja važni su visokokvalitetni primeri i predlošci. Stoga, kada se odabiru početnice, one bi trebale biti jedinstvene za određenu regiju u kojoj želimo sekvencirati. PCR Primeri su kratki DNA lanci s duljinom nukleotida od 18-25 koji je kompatibilan s početnim i krajnjim područjem DNA fragmenata koji se trebaju umnožiti. PCR početnice mogu biti prednje početnice i obrnute početnice. Sadržaj gvanina i citozina (GC) u dobrom primeru trebao bi biti u rasponu od 40-60. Temperatura žarenja primera i temperatura taljenja vitalni su aspekti tijekom PCR-a. Ovo je razlika između PCR početnica i početnica za sekvenciranje.
