Ključna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja iz puške leži u njihovoj metodi ponašanja. Metoda sekvenciranja klon po klon uključuje mapiranje kromosoma i kloniranje prije sekvenciranja, dok sekvenciranje kloniranjem sačmaricom izostavlja korake mapiranja kromosoma i kloniranja tijekom sekvenciranja.
Klon sekvenciranjem klona i sekvenciranjem kloniranjem puškom dvije su metode suvremenog sekvenciranja genoma. Sekvenciranje klon po klon je pouzdanija metoda sekvenciranja. Međutim, metoda kloniranja sačmaricom je brža i jeftinija. Članak se fokusira na suptilnu razliku između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice.
Što je kloniranje sekvenciranjem klonova?
Klon po klonu sekvenciranje je metoda sekvenciranja genoma. Zahtijeva mapiranje svakog kromosoma prije cijepanja DNK. Nakon mapiranja, DNK bi se trebala rastaviti na fragmente duge 150 kilobaza. Ti su fragmenti tada spremni za sekvenciranje. Sljedeći korak je umetanje fragmenata DNA u bakterijske umjetne kromosome (BACs), a zatim u bakterijske stanice. Budući da su fragmenti sada unutar bakterijskih stanica, svaki put kada se bakterije dijele, umetnuti fragmenti DNK također se dijele i proizvode mnogo identičnih kopija. Zatim se DNA pojedinačnog bakterijskog klona fragmentira u fragmente duge 500 parova baza. Oni su manji i preklapajući fragmenti. Zatim se odvija sekvenciranje umetanjem tih fragmenata u vektor s poznatim slijedom DNK. Počevši od poznatog niza vektora, sekvenciranje se nastavlja do nepoznatog niza.
Nakon završetka sekvenciranja potrebno je identificirati područja preklapanja sekvenci. Nakon toga dolazi do spajanja fragmenata kako bi se formirali veći fragmenti inicijalno prisutni u BAC-ovima. Zatim se odvija sklapanje većih fragmenata u kromosom prema mapi genoma.
Slika 01: Klon po klon sekvenciranju
Značajna prednost sekvenciranja klon po klon je u tome što unaprijed pripremljena mapa genoma pomaže u pouzdanom sklapanju većih fragmenata. No, nedostatak ove metode sekvenciranja je dugotrajan za generiranje mapa genoma i izradu klonova. Međutim, to je bila metoda koja se preferirala tijekom 'Projekta ljudskog genoma'.
Što je klon sekvenciranjem sačmarice?
Clone by shotgun sekvencioniranje je metoda sekvenciranja koja nasumično razbija sekvence DNK u mnogo malih fragmenata i ponovno sastavlja sekvencu promatranjem preklapajućih regija. Veće genome sisavaca teško je klonirati i sastaviti. To je zbog njihove strukturne složenosti i veličine. Iako je metoda sekvenciranja klon po klon pouzdana, potrebno je puno vremena da se sekvenciraju genomi složenih organizama. Stoga je klon sekvencioniranjem iz puške postalo pouzdana, jeftinija metoda sekvencioniranja koja se može izvesti brže. Stoga se moderni znanstvenici oslanjaju na ovu metodu sekvenciranja kako bi se uhvatili u koštac sa složenim genomima.
Slika 02: Klon sekvenciranjem sačmarice
Tijekom kloniranja metodom sekvencioniranja shotgun, ne odvijaju se konvencionalni koraci mapiranja genoma i kloniranja. U početku je cijeli genom fragmentiran u različite veličine od 20 kilobaza do 300 kilobaza. Zatim slijedi sekvenciranje. Zatim je pomoću sofisticiranog računalnog softvera potrebno sastaviti fragmente promatrajući područja koja se preklapaju.
Klon sekvenciranjem sačmarice pomaže u poboljšanju točnosti postojećih sekvenci genoma. Glavna prednost ove metode je da je puno brža i jeftinija od metode sekvenciranja klon po klon. Međutim, ovaj proces ne uključuje korištenje genetske karte. Stoga je vjerojatnije da će se pojaviti pogreške tijekom sastavljanja. Prema tome, ovo je veliki nedostatak kod kloniranja metodom sekvencioniranja sačmarice.
Koje su sličnosti između sekvenciranja kloniranja po klonu i sekvenciranja sačmarice?
- I klon po klon sekvencioniranje i shotgun sekvencioniranje dvije su metode sekvencioniranja genoma.
- Tijekom obje tehnike sekvenciranja, sklapanje rastavljenih fragmenata odvija se identificiranjem preklapajućih regija.
- Također, rastavljanje DNK na manje fragmente potrebno je i za kloniranje i za sekvenciranje sačmarice.
Koja je razlika između slijeda kloniranja po klonu i sekvenciranja sačmarice?
Tehnika sekvencioniranja klona po klonu uključuje dva glavna koraka: mapiranje kromosoma i kloniranje. Nasuprot tome, klon sekvenciranjem sačmarice ne slijedi ova dva koraka; nasumično razbija sekvence DNK u mnogo malih fragmenata i ponovno sastavlja sekvencu promatrajući regije koje se preklapaju. Dakle, ovo je ključna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice. Zbog ovog faktora, sekvenciranje klon po klon je skup i dugotrajan proces, dok je sekvenciranje klon po klonu brže i jeftinije.
Međutim, manje je vjerojatno da će se pojaviti pogreške tijekom sklapanja tijekom sekvenciranja klon po klon. Stoga ima visoku pouzdanost. Međutim, klon sekvenciranjem sačmarice relativno je manje pouzdana tehnika. Dakle, ovo je također značajna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice.
Info-grafika u nastavku predstavlja više informacija o razlici između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice.
Sažetak – klon po klon sekvenciranje u odnosu na sekvenciranje sačmarice
U sažetku razlike između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice, sekvenciranje klon po klon i sekvenciranje sačmarice dvije su metode sekvenciranja genoma. Međutim, tehnika sekvenciranja klon po klon uključuje procese mapiranja genoma i kloniranja, dok sekvenciranje kloniranjem sačmaricom ne uključuje. Dakle, ovo je ključna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice. Budući da se mapiranje genoma odvija tijekom sekvenciranja klon po klon, manje je vjerojatno da će doći do pogrešaka tijekom sastavljanja sekvenci. Ali, klon sekvenciranjem sačmarice puno je brži i jeftiniji proces. Ipak, relativno je manje pouzdan. Sekvenciranje klon po klon bilo je preferirana metoda sekvenciranja tijekom 'Projekta ljudskog genoma'. Ali, moderni molekularni biolog više se oslanja na kloniranje sekvenciranjem iz puške.
