Ključna razlika – kloniranje gena u odnosu na PCR
Sinteza mnogih kopija DNA iz specifičnog fragmenta DNA naziva se pojačanje DNA. Postoje dva glavna procesa umnožavanja DNK, naime kloniranje gena i PCR. Ključna razlika između kloniranja gena i PCR-a je da kloniranje gena proizvodi višestruke kopije specifičnog gena in vivo konstruiranjem rekombinantne DNA i rastom unutar bakterije domaćina, dok PCR proizvodi milijune kopija specifičnog fragmenta DNA in vitro koji prolazi kroz ponovljene cikluse denaturacija i sinteza.
Što je kloniranje gena?
Kloniranje gena je tehnika koja se koristi za lociranje i umnožavanje specifičnog gena iz ekstrahirane genomske DNK organizma putem konstrukcije rekombinantne DNK. Genomska DNK sadrži tisuće različitih gena kodiranih za proteine. Kada se DNK izdvoji, uključuje sve moguće gene koje može nositi. Tehnika kloniranja gena omogućila je detekciju specifičnog gena iz ukupne DNK. Stoga kloniranje gena služi kao važan alat u molekularnoj biologiji.
Izrada genomske biblioteke organizma neophodna je u kloniranju gena ako ne postoji trag o lokaciji relevantnog gena u DNK. Genomska biblioteka izrađuje se pomoću sljedećih koraka.
Korak 1: Ekstrakcija ukupne DNK iz organizma koji sadrži željeni gen.
Korak 2: Ograničenje probave ekstrahirane DNK da bi se proizveli mali fragmenti kojima se može upravljati. Ovaj korak olakšavaju restrikcijske endonukleaze.
Korak 3: Odabir prikladnog vektora i otvaranje vektorske DNA korištenjem istih restrikcijskih endonukleaza. Bakterijski plazmidi obično se koriste kao vektori za prijenos strane DNK. Plazmidi su mali krugovi DNK koji se nalaze unutar bakterija.
Korak 4: Kombinacija vektorske DNA i fragmentirane DNA za proizvodnju rekombinantne DNA molekule. Ovim korakom upravlja DNA ligaza.
Korak 5: Prijenos molekula rekombinantne DNA u bakterije domaćine. Ovaj korak je poznat kao transformacija, a izvodi se toplinskim šokom.
Korak 5: Pregled transformiranih bakterijskih stanica na mediju kulture. Mješovita populacija transformiranih i netransformiranih stanica domaćina dobiva se na kraju procesa transformacije. Budući da je gen od interesa uključen samo u transformirane stanice domaćina. Stoga je potrebno odabrati transformirane stanice. Odabir se vrši pomoću selektivnih podloga koje sadrže antibiotike. Samo transformirane stanice rastu na ovom mediju za probir omogućujući odabir.
Korak 6: Uzgoj bakterija za proizvodnju knjižnice gena. U ovom koraku, transformirane stanice domaćina uvode se u svježi medij kulture koji osigurava optimalne zahtjeve rasta. Ukupne kolonije na pločama kulture predstavljaju genomsku biblioteku tog organizma.
Korak 7: Molekula rekombinantne DNA koja sadrži gen od interesa mora se pregledati iz tisuća kloniranih fragmenata rekombinantne DNA. Može se postići korištenjem sondi koje označavaju određeni gen ili specifični protein koji proizlazi iz tog gena.
Nakon što se iz ukupnih kolonija identificira željeni gen koji sadrži bakterijsku koloniju, moguće je napraviti milijune kopija rekombinantnog plazmida koji sadrži gen.
Kloniranje gena koristi se za uspostavljanje biblioteka gena, proizvodnju posebnih proteina, vitamina, antibiotika, hormona, sekvenciranje i mapiranje genoma organizama, izradu višestrukih kopija DNK pojedinca u forenzici itd.
Slika_1: Kloniranje gena
Što je PCR?
Lančana reakcija polimerazom (PCR) je tehnika koja generira veliki broj kopija određenog fragmenta DNA. Eksponencijalno umnožavanje specifične sekvence DNA postiže se PCR-om u in vitro uvjetima. Ova tehnika je vrlo moćan alat u molekularnoj biologiji budući da može umnožiti mali uzorak DNK u upotrebljivu količinu. PCR je uveo Kary Mullis 1983. i ovaj nagrađivani izum stvorio je veliki napredak u molekularnoj biologiji.
PCR tehnika slijedi ponovljene PCR reakcije kao što je prikazano na slici 02. Jedna PCR reakcija sastoji se od tri glavna koraka koji se odvijaju na tri različite temperature; denaturacija dvolančane DNA na 94 0C, žarenje početnica na 68 0C i produljenje lanca na 72 0 C. Stoga, kada se provodi PCR, temperaturne fluktuacije trebaju biti visoko održavane radi pravilne replikacije. PCR se izvodi u PCR stroju unutar PCR epruveta. PCR epruvete su napunjene ispravnim PCR smjesama koje sadrže predlošku DNK, Taq polimerazu, početnice, dNTP i pufer. Denaturacija dvolančane DNA uzorka u jednolančanu DNA vrši se kidanjem vodikovih veza između komplementarnih baza na 94 – 98 0C. Zatim se pojedinačne niti šablonske DNK izlažu za početnice. Treba osigurati par primera (naprijed i unazad) i oni moraju biti termostabilni da podnose visoke temperature. Primeri su jednolančani kratki nizovi DNA komplementarni krajevima ciljnog fragmenta DNA. U PCR-u se koriste sintetski primeri. Primeri se vežu s komplementarnim bazama uzorka DNA i pokreću sintezu novog lanca. Ovaj korak katalizira enzim koji se zove Taq polimeraza; termostabilni enzim DNA polimeraza izoliran iz Thermus auqaticus. Kada su početnice i nukleotidi (građevni blokovi) dostupni, Taq polimeraza konstruira novi lanac DNA komplementaran šablonskoj DNA. Na kraju PCR programa, umnoženi fragment DNA promatra se pomoću gel elektroforeze. Ako je potrebna daljnja analiza, PCR proizvod se pročišćava iz gela.
PCR je vrlo koristan za dijagnosticiranje i praćenje genetskih i stečenih bolesti, identifikaciju kriminalaca (u području forenzike), proučavanje strukture i funkcije ciljanog segmenta DNA, sekvenciranje i mapiranje genoma organizama, itd. PCR je među znanstvenicima postao rutinska laboratorijska tehnika u istraživačkim laboratorijima za medicinu i molekularnu biologiju budući da ima široku paletu primjena.
Slika_2: Lančana reakcija polimerazom
Koja je razlika između kloniranja gena i PCR-a?
Kloniranje gena u odnosu na PCR |
|
| Kloniranje gena je proces stvaranja višestrukih kopija specifičnog gena in vivo putem rekombinantne DNK i transformacije u bakteriju domaćina. | PCR tehnika proizvodi višestruke kopije određene DNA sekvence in vitro kroz ponovljene cikluse PCR reakcija. |
| Zahtjev za konstrukciju rekombinantne DNK | |
| Rekombinantna DNA se proizvodi kako bi se locirao gen. | Rekombinantna DNK se ne proizvodi. |
| Potreba za radnom snagom | |
| Ovaj proces je radno intenzivan. | Nije potreban intenzivan trud. |
| In vivo ili In vitro proces | |
| Konstrukcija rekombinantne DNA je in vitro, a amplifikacija DNA in vivo. | Umnožavanje DNK događa se potpuno in vitro. |
Sažetak – Kloniranje gena u odnosu na PCR
Kloniranje gena i PCR dvije su metode koje se koriste za umnožavanje DNK. PCR je in vitro proces koji stvara višestruke kopije DNK određenog DNK fragmenta bez upotrebe rekombinantne DNK i organizma domaćina. Kloniranje gena prvenstveno je in vivo proces koji rezultira višestrukim kopijama zainteresiranog gena unutar organizma domaćina putem konstrukcije rekombinantne DNA. Ovo je razlika između kloniranja gena i PCR-a.
