Ključna razlika – kloniranje naspram subkloniranja
Kloniranje i subkloniranje su molekularno biološki postupci koji stvaraju genetski identične stanice ili organizme koji nose DNK ili gen koji su od interesa. Kloniranje je tehnika koja uključuje umetanje željenog gena ili DNK u vektor, njegovu replikaciju unutar bakterije domaćina i proizvodnju stanica ili organizama koji su točne kopije genetskog sastava. Subkloniranje je tehnika koja uključuje umetanje gena od interesa, koji je već umetnut u vektor, u sekundarni vektor, njegovu replikaciju unutar bakterije domaćina i proizvodnju genetski identičnih kopija stanica ili organizama. Ključna razlika između kloniranja i subkloniranja je u tome što, kod kloniranja, gen od interesa, nakon što je povezan u vektor, nastavlja proces kloniranja, dok se kod subkloniranja već klonirani gen od interesa odvaja od roditeljskog vektora i ponovno umeće u vektor. vektor primatelja i nastavite s procesom.
Što je kloniranje?
Kloniranje je postupak kojim se proizvode genetski identični organizmi ili stanice. U prirodi se kloniranje događa putem nespolnog razmnožavanja. Kada nema genetske rekombinacije ili promjene, stanice kćeri dobivaju isti genetski sastav roditelja. Prokariotski i eukariotski organizmi stvaraju klonove binarnom fisijom, pupanjem, mitozom itd. U molekularnoj biologiji, kloniranje gena ili specifičnih fragmenata DNK popularna je metoda za proučavanje strukture i funkcije tog određenog dijela DNK.
Glavni cilj molekularnog kloniranja je napraviti milijune kopija genetski identičnih stanica ili organizama koji nose fragment DNK od interesa (uglavnom gene). Stvara organizme s točnim genetskim kopijama drugih. Prvenstveno se specifični geni kloniraju u molekularnim studijama kako bi se dobile strukturne i funkcionalne informacije i za sekvenciranje DNA. Također, za proizvodnju specifičnih proteina ili proizvoda u velikim razmjerima, kloniranje se široko koristi.
Procedura kloniranja
Osnovni koraci postupka kloniranja su sljedeći.
- Identifikacija i izolacija gena od interesa. (Umnožavanje gena od interesa pomoću PCR-a).
- Restrikcijska probava gena od interesa (restrikcijska endonukleaza reže gen).
- Restrikcijska probava vektorske DNA. (Vektorska DNA također je izrezana pomoću iste restrikcijske endonukleaze).
- Umetanje gena u vektor i stvaranje rekombinantne molekule.
- Transformacija rekombinantnog vektora u bakteriju domaćina.
- Izolacija i identifikacija transformiranih bakterija (plazmidni vektor treba sadržavati gen koji se može odabrati, najčešće gen otpornosti na antibiotike za pretraživanje transformiranih bakterija).
- Rekombinantna ekspresija gena unutar domaćina.
Slika_01: Postupak kloniranja
Što je subkloniranje?
Subkloniranje je postupak premještanja gena od interesa s jednog vektora na drugi vektor kako bi se vidjela ekspresija gena kako bi se dobila željena funkcionalnost gena. U ovoj metodi uključena su dva vektora; naime roditeljski vektor i odredišni vektor. Klonirani umetci se ponovno premještaju u drugi vektor u subkloniranju. Cilj prijenosa gena iz prvog vektora u drugi vektor je dobiti nešto što prvi vektor nije mogao učiniti ili ponovno odvojiti gen unutar već kloniranog fragmenta DNA i eksprimirati ga samog. U ovom postupku na početku se koriste restrikcijski enzimi.
Procedura podkloniranja
Osnovni koraci subkloniranja su sljedeći.
- Uz pomoć restrikcijskih endonukleaza, odvajanje DNA od interesa u donorskom plazmidu (roditeljski vektor).
- Umnožavanje DNK od interesa pomoću PCR-a.
- Pročišćavanje PCR proizvoda (DNA od interesa) elektroforezom u gelu.
- Otvaranje plazmida primatelja istim restrikcijskim endonukleazama koje se koriste za odvajanje DNA od interesa u roditeljskom plazmidu.
- Ligacija DNA od interesa (gen) u primateljski plazmid kako bi se stvorio subklonirani plazmid.
- Transformacija subkloniranog vektora u kompetentnu bakteriju domaćina.
- Provjera transformiranih stanica.
- Pročišćavanje plazmidne DNA i upotreba za sekvenciranje DNA ili ekspresiju gena za dobivanje željenih proizvoda.
Podkloniranje se provodi u prilikama izolacije jednog gena iz klonirane skupine gena ili kada se gen od interesa mora prenijeti u koristan plazmid kako bi se vidjela točna funkcija gena od interesa.
Slika_02: Postupak subkloniranja
Koja je razlika između kloniranja i subkloniranja?
Kloniranje protiv podkloniranja |
|
| Kloniranje je postupak kojim se proizvode genetski identični organizmi ili stanice. | Subkloniranje je postupak premještanja gena od interesa s jednog vektora na drugi vektor kako bi se vidjela ekspresija gena kako bi se dobila željena funkcionalnost gena. |
| Proces | |
| Odvojite DNK od interesa od organizma i jednom umetnite u vektor i klonirajte | Već klonirana DNK se odvaja od prvog vektora i umeće u drugi vektor i klonira. |
| Umetni pokret putem vektora | |
| Ne premješta umetke (DNK od interesa) iz jednog vektora u drugi vektor. | Premještanje umetaka iz roditeljskog vektora u odredišni vektor. |
Sažetak – Kloniranje protiv subkloniranja
Kloniranjem se stvaraju genetski identične stanice ili organizmi s umetnutim genom ili DNK od interesa. Nastavlja se odvajanjem i umetanjem DNK od interesa u vektor i ekspresijom unutar bakterije domaćina. Subkloniranje dijeli slične korake kao i kloniranje. Međutim, kod subkloniranja, već klonirani fragment DNA (gen od interesa) umeće se u vektor i transformira u bakteriju domaćina. To je ključna razlika između kloniranja i subkloniranja.
