Ključna razlika – Northern vs Southern vs Western Blotting
Detekcija specifičnih sekvenci DNA, RNA i proteina ključna je za različite vrste studija u molekularnoj biologiji. Gel elektroforeza je tehnika koja razdvaja DNA, RNA i proteine prema njihovoj veličini. Iz profila gela, određena DNA sekvenca, RNA sekvenca ili protein detektiraju se posebnim tehnikama koje se nazivaju blotiranje i hibridizacija s obilježenim probama. Postoje tri različite vrste metoda upijanja, naime južni, sjeverni i zapadni. Ključna razlika između Northern Southern i Western blottinga leži u vrsti molekule koju detektira iz uzorka. Southern blotting je metoda koja otkriva specifičnu sekvencu DNK iz DNK uzorka. Northern blot je tehnika koja otkriva specifičnu RNA sekvencu iz RNA uzorka. Western blotting je metoda koja otkriva specifičan protein iz uzorka proteina.
Što je Southern Blotting?
Southern blotting tehniku razvio je E. M. Southern 1975. godine za identifikaciju specifične DNK sekvence iz DNK uzorka. Ovo je prva tehnika upijanja uvedena u molekularnu biologiju. Omogućio je otkrivanje specifičnih gena iz DNK, specifičnih fragmenata iz DNK, itd. Nekoliko je koraka uključenih u Southern blotting tehniku. Oni su sljedeći.
- DNA se izolira iz uzorka i probavlja restrikcijskim endonukleazama.
- Probavljeni uzorak se odvaja elektroforezom u agaroza gelu.
- Fragmenti DNA u gelu denaturiraju se u pojedinačne niti pomoću alkalne otopine.
- Jednolančana DNA prenosi se na nitroceluloznu filtarsku membranu kapilarnim prijenosom.
- Prenesena DNK je trajno fiksirana na membranu.
- Fiksirana DNA na membrani je hibridizirana s označenim sondama.
- Nevezana DNA se ispire s membrane pranjem.
- X-zraka se izlaže membrani i priprema se autoradiografija.
Southern blotting se primjenjuje za različite aspekte molekularne biologije. Koristan je u RFLP mapiranju, forenzičkim studijama, metilaciji DNK u ekspresiji gena, otkrivanju mutiranih gena u genetskim poremećajima, DNK otiscima itd.
Slika 01: Southern blotting tehnika
Što je Northern Blotting?
Northern blotting je metoda dizajnirana za otkrivanje specifične RNA sekvence ili mRNA sekvence iz uzorka za proučavanje ekspresije gena. Ovu su tehniku razvili Alwine, Kemp i Stark 1979. Razlikuje se od southern i western blotting tehnika zbog nekoliko koraka. Međutim, ova se tehnika također izvodi putem gel elektroforeze, blotinga i hibridizacije sa specifičnim obilježenim probama i detekcijom. Northern blotting tehnika izvodi se na sljedeći način.
- RNA se ekstrahira iz uzorka i odvaja elektroforezom u gelu.
- RNA se prenosi iz gela na upijajuću membranu i fiksira.
- Membrana se tretira označenom sondom pripremljenom od cDNA ili RNA (sonda je komplementarna specifičnoj sekvenci u uzorku).
- Sonda se inkubira s membranom kako bi se vezala određenom sekvencom.
- Nevezane sonde se isperu.
- Hibridizirane fragmente otkriva autoradiograf.
Northern blotting je važan alat u otkrivanju i kvantifikaciji hibridizirane mRNA, proučavanju razgradnje RNA, procjeni poluživota RNA, otkrivanju spajanja RNA, proučavanju ekspresije gena, itd.
Slika 02: Northern Blotting
Što je Western Blotting?
Western blot je metoda otkrivanja specifičnog proteina iz mješavine proteina upotrebom obilježenog antitijela. Stoga je Western blot također poznat kao imunoblot. Ovu su tehniku uveli Towbin i suradnici 1979. i sada se rutinski provodi u laboratorijima za analizu proteina. Koraci su sljedeći.
- Proteini se ekstrahiraju iz uzorka
- Proteini se odvajaju po veličini elektroforezom u poliakrilamidnom gelu
- Razdvojene molekule se elektroporacijom prenose u PVDF membranu ili nitroceluloznu membranu
- Membrana je blokirana za nespecifično vezanje s protutijelima
- Preneseni proteini vezani su s primarnim antitijelima (antitijela označena enzimima).
- Membrana se pere kako bi se uklonila nespecifično vezana primarna antitijela
- Vezana protutijela otkrivaju se dodavanjem supstrata i otkrivanjem nastalog obojenog taloga
Western blot je koristan u detekciji anti-HIV antitijela u uzorku ljudskog seruma. Western blot se također može koristiti kao potvrdni test za infekciju hepatitisom B i definitivni test za kravlje ludilo.
Slika 03: Western blotting
Koja je razlika između Northern Southern i Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western blotting |
|
| Detektirana vrsta molekule | |
| Northern Blotting | Northern blotting otkriva specifičnu RNA sekvencu iz RNA uzorka. |
| Southern Blotting | Southern blotting otkriva specifičnu DNK sekvencu iz DNK uzorka. |
| Western Blotting | Western blotting detektira određeni protein iz uzorka proteina. |
| Vrsta gela | |
| Northern Blotting | Ovo koristi agarozni/formaldehidni gel. |
| Southern Blotting | Ovo koristi agarozni gel. |
| Western Blotting | Ovo koristi poliakrilamidni gel. |
| Metoda upijanja | |
| Northern Blotting | Ovo je kapilarni prijenos. |
| Southern Blotting | Ovo je kapilarni prijenos. |
| Western Blotting | Ovo je električni prijenos. |
| Upotrijebljene sonde | |
| Northern Blotting | cDNA ili RNA sonde označene radioaktivno ili neradioaktivno. |
| Southern Blotting | DNA sonde su označene radioaktivno ili neradioaktivno. |
| Western Blotting | Primarna protutijela koriste se kao sonde. |
| Sustav detekcije | |
| Northern Blotting | Ovo se radi pomoću autoradiografa ili otkrivanja svjetla ili promjene boje. |
| Southern Blotting | Ovo se radi pomoću autoradiografa, detekcije svjetlosti ili promjene boje. |
| Western Blotting | Ovo se radi pomoću detekcije svjetlosti ili promjene boje. |
Sažetak – Northern vs Southern vs Western blotting
Blotting je posebna tehnika razvijena za identifikaciju specifične DNA, RNA ili proteina iz uzoraka. Postoje tri odvojena postupka upijanja, naime sjeverni, južni i zapadni, za otkrivanje specifične vrste molekule. Northern blotting tehnika dizajnirana je za otkrivanje specifične RNA sekvence iz mješavine RNA. Southern blotting tehnika omogućuje otkrivanje specifične sekvence DNA iz uzorka DNA, a western blotting tehnika razvijena je za identifikaciju specifičnog proteina iz mješavine proteina.
