Ključna razlika – podvezivanje tupim ili ljepljivim krajem
Restrikcijske endonukleaze su specifični enzimi koji režu dvolančanu DNA (dsDNA). Također su poznate kao molekularne škare u molekularnoj biologiji. Restrikcijski enzimi mogu prepoznati specifične kratke sekvence dsDNA poznate kao mjesta prepoznavanja i cijepati fosfodiesterske i vodikove veze kako bi otvorili dvostruke niti. Kao rezultat cijepanja ovim enzimima, nastaju fragmenti DNK s različitim vrstama krajeva kao što su ljepljivi i tupi krajevi. DNA ligaza je enzim koji se koristi u molekularnoj biologiji za spajanje dvaju susjednih lanaca DNA stvaranjem novih veza. Korak je poznat kao ligacija, a prema vrsti vezanog kraja DNK, može se nazvati ligacijom tupog kraja i ligacijom ljepljivog kraja. Ključna razlika između ligacije tupih i ljepljivih krajeva je u tome što se ligacija tupih krajeva događa između fragmenata DNK koji sadrže dva tupa kraja, dok se ligacija ljepljivih krajeva događa između 5' i 3' prepusta. U usporedbi s ligacijom s tupim krajem, ligacija s ljepljivim krajem je učinkovitija i stabilnija.
Što je podvezivanje tupim krajem?
Neke restrikcijske endonukleaze mogu rezati DNA na suprotnim bazama i proizvesti fragmente DNA s tupim krajevima. Ovi enzimi poznati su kao rezači s tupim krajevima; cijepaju se ravno do sredine restrikcijskog mjesta bez ostavljanja jednolančanih nadvišenih baza. Tupi krajevi također su poznati kao neviseći krajevi jer nemaju 3' i 5' nadvišene baze na krajevima. Obje niti završavaju s parovima baza na tupim krajevima. Uobičajeni enzimi za rezanje tupim krajevima su EcoRV HaeIII, AluI i SmaI.
Ligacija tupog kraja je uključena između dva tupa kraja. Nije podvezivanje izbočenih baza. Ova ligacija je manje učinkovita od ligacije ljepljivog kraja. Međutim, u nekim prilikama ligacija s tupim krajevima postaje korisnija od ligacije s ljepljivim krajevima, osobito kada se ligiraju PCR proizvodi. PCR proizvodi se uvijek proizvode s tupim krajevima. Ligacija s tupim krajem ne zahtijeva komplementarne krajeve u DNK za ligaciju.
Slika 01: Proizvodnja tupog kraja pomoću enzima Eco RV
Što je podvezivanje ljepljivog kraja?
Neke restrikcijske endonukleaze mogu rezati dsDNA, ostavljajući dio jednolančane DNA koji visi na kraju. Ti su krajevi poznati kao ljepljivi ili viseći krajevi. Vezanje ljepljivih krajeva događa se između dva fragmenta DNA koji sadrže podudarne prevjese jer ljepljivi krajevi posjeduju nesparene baze i zahtijevaju komplementarne baze za stvaranje veza. Stoga je potrebno upotrijebiti isti restrikcijski enzim za oba izvora DNA kako bi se proizveli podudarni ligacijski fragmenti.
Ligacija ljepljivog kraja je učinkovitija i često je vrlo poželjna u procesima kloniranja. Postoji nekoliko restrikcijskih enzima koji proizvode ljepljive vrhove. To su EcoRI, BamHI, HindIII itd.
Slika 02: Proizvodnja ljepljivog kraja pomoću Eco RI enzima
Koja je razlika između podvezivanja tupim i ljepljivim krajem?
Tupo nasuprot ljepljivom podvezivanju |
|
| Vezivanje tupih krajeva događa se između dva fragmenta DNA tupih krajeva. | Povezivanje ljepljivih krajeva događa se između dva podudarna fragmenta DNK s ljepljivim krajevima. |
| Enzimi | |
| Rezači s tupim krajevima proizvode tupe krajeve. | Rezači za ljepljive krajeve proizvode ljepljive ili spojene krajeve. |
| Zahtjev za podudaranje krajeva | |
| Ne zahtijeva podudarne fragmente ili komplementarne baze. | Zahtijeva komplementarne baze na krajevima za formiranje parova baza. |
| Učinkovitost | |
| Manje je učinkovito od podvezivanja ljepljivog kraja | Učinkovitije je od podvezivanja tupim krajem. |
Sažetak – podvezivanje tupim ili ljepljivim krajem
Restrikcijske endonukleaze mogu cijepati dsDNA i proizvoditi fragmente DNA s različitim krajevima. Oni prepoznaju specifične sekvence i ograničavaju DNK stvarajući ljepljive i tupe krajeve. Ljepljivi krajevi imaju nesparene baze na kraju fragmenata. Tupi vrhovi nastaju zbog ravnog dekoltea i imaju parove baza na krajevima. Vezanje ljepljivog kraja zahtijeva dva komplementarna jednolančana DNK dijela. Podvezivanje tupih krajeva događa se između bilo koja dva fragmenta tupih krajeva. Ovo je razlika između tupog i ljepljivog podvezivanja.
