Ključna razlika – Nick Translation vs Primer Extension
Nick prijevod i ekstenzija primera dvije su važne tehnike koje se izvode u molekularnoj biologiji. Ključna razlika između translacije nicka i ekstenzije primera je u tome što proces translacije nicka proizvodi označene sonde za druge tehnike hibridizacije, dok metoda ekstenzije primera identificira specifičnu RNA sekvencu iz mješavine i otkriva informacije o ekspresiji mRNA. Obje tehnike imaju veliku važnost i rutinski se izvode u laboratorijima za molekularna istraživanja.
Što je Nick Translation?
Nick translacija je važna tehnika koja se koristi za pripremu označenih sondi za različite molekularne biološke tehnike kao što su blotiranje, in situ hibridizacija, fluorescentna in situ hibridizacija itd. To je in vitro metoda označavanja DNK. DNA sonde se koriste za identifikaciju specifičnih DNA ili RNA sekvenci. Uz pomoć obilježene sonde, specifični fragmenti mogu se označiti ili vizualizirati iz složene mješavine nukleinske kiseline. Stoga se obilježene sonde pripremaju različitim tehnikama koje se koriste za različite tehnike. Nick translacija je jedna takva metoda koja proizvodi obilježene sonde uz pomoć enzima DNaze 1 i DNK polimeraze 1.
Proces prevođenja nadimka počinje aktivnošću enzima DNaze 1. DNaza 1 uvodi pukotine u fosfatnu okosnicu dvolančane DNA cijepanjem fosfodiesterskih veza između nukleotida. Nakon što je nick stvoren, slobodna 3’ OH skupina nukleotida će se dati i na nju će djelovati enzim DNA polimeraza 1. 5’ do 3’ egzonukleazna aktivnost DNA polimeraze 1 uklanja nukleotide iz nicka prema 3’ smjeru DNA lanca. Istovremeno djeluje polimerazna aktivnost enzima DNA polimeraze 1 i dodaje nukleotide kako bi zamijenili uklonjene nukleotide. Ako su nukleotidi bili obilježeni, zamjena će se dogoditi označenim nukleotidima i to će označiti DNK za identifikaciju. Ova novosintetizirana obilježena DNK može se koristiti kao sonda u raznim reakcijama hibridizacije u molekularnoj biologiji.
Slika 01: Proces prevođenja nadimka
Što je Primer Extension?
Proširenje početnica je tehnika koja se koristi za pronalaženje specifične RNA sekvence iz RNA mješavine i lociranje 5’ kraja mRNA transkripta. Također se koristi za proučavanje strukture RNK i ekspresije. Metoda ekstenzije početnica provodi se s obilježenim početnicama ili s obilježenim nukleotidima. Ako se koriste obilježeni primeri, to isključuje potrebu označavanja nukleotida koji se koriste za sintezu cDNA. Postoji nekoliko koraka u ovoj tehnici. Započinje ekstrakcijom RNK iz uzorka. Zatim se u smjesu dodaje obilježeni oligonukleotidni primer zajedno s potrebnim sastojcima za sintezu cDNA specifične RNA sekvence. Primer se žari s komplementarnim nizom iz smjese. Koristeći slijed žarene početnice kao predložak, enzim reverzna transkriptaza sintetizira komplementarnu DNA (cDNA) sekvence RNA. Spajanje primera i reverzna transkripcija događaju se samo kada je specifična RNA sekvenca prisutna u uzorku. Konačno, kada se provodi denaturirajuća gel elektroforeza, može se odrediti veličina RNA sekvence. Također je lako pronaći +1 bazu sekvence mRNA (mjesto inicijacije transkripcije) metodom ekstenzije primera. Količina mRNA prisutna u uzorku može se kvantificirati ovom metodom ako se koristi višak primera.
Slika 02: Ekstenzija Primera
Koja je razlika između Nick Translation i Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick prijevod je proces koji stvara obilježene DNK sonde za različite reakcije hibridizacije. | Proširenje primera je tehnika koja se koristi za pronalaženje specifične RNA ili za proučavanje ekspresije gena. |
| Upotrijebljeni enzimi | |
| Koriste se enzimi DNaza 1 i DNK polimeraza. | Koristi se enzim reverzne transkriptaze. |
| Važnost | |
| Nick prijevod olakšava označavanje specifične sekvence DNK. | Proširenje primera omogućuje otkrivanje specifične veličine sekvence mRNA i količine prisutne u uzorku. |
Sažetak – Nick Translation vs Primer Extension
Nick prijevod je metoda koja se koristi za sintetiziranje obilježenih sondi na temelju aktivnosti enzima DNaze 1 i E coli DNA polimeraze 1. To je in vitro metoda koja se koristi u laboratorijima prije različitih tehnika hibridizacije. Tijekom translacije nicka, aktivnost 5’-3’ egzonukleaze DNA polimeraze 1 uklanja nukleotide ispred nicka, a aktivnost polimeraze DNA polimeraze 1 zamjenjuje uklonjene nukleotide s označenim nukleotidima iza nicka. Ekstenzija primera je metoda koja se koristi za otkrivanje specifičnog RNA transkripta iz mješavine i kvantificiranje veličine i količine interesne RNA. Ovo je razlika između prijevoda nadimka i ekstenzije početnika.
