Ključna razlika između Golden Gatea i Gibson Assemblya je u tome što se Golden Gate oslanja na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati, dok se Gibson Assembly ne oslanja na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence biti kloniran.
Tijekom proteklih desetljeća molekularni znanstvenici razvili su različite standardizirane postupke koji omogućuju lakše sastavljanje više fragmenata DNK u jedan dio. Stoga istraživači u znanstvenim eksperimentima naširoko koriste metode kloniranja kao što su Ligacija restrikcijskim enzimom, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly i TOPO Cloning. Stoga su Golden Gate i Gibson Assembly dvije metode molekularnog kloniranja koje omogućuju sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad.
Što je Golden Gate Assembly?
Golden Gate je metoda molekularnog kloniranja koja olakšava sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad. Ova se metoda oslanja na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati. Nastala je 1996. Ova tehnika koristi restrikcijske enzime tipa IIS i T4 DNA ligazu. Ovi enzimi režu DNK izvan mjesta prepoznavanja. Oni mogu stvoriti nepalindromske prepuste. Stoga se višestruki fragmenti DNK mogu sastaviti korištenjem kombinacija prepuštenih sekvenci.
Slika 01: Golden Gate
Procedura sklapanja Golden Gatea
Tehnika Golden Gate ima glavna tri koraka u svom postupku:
- stvaranje prevjesa u vektoru za kloniranje,
- sastavljanje višestrukih DNK umetaka korištenjem sekvenci specifičnih za fragmente u prevjesima, i
- ligacija.
Golden Gate sklop koristi vektore kružnog kloniranja (odredišni vektor). Nadalje, u ovoj metodi, restrikcijsko mjesto se eliminira iz ligiranog proizvoda kako bi se istovremeno izvršila probava i ligacija. Tipični protokol toplinskog ciklusa za Golden Gate oscilira između 37 °C i 16 °C jer je 37 °C optimalno za restrikcijske enzime, a 16 °C je optimalno za ligaze.
Što je Gibson sklop?
Gibson Assembly je metoda molekularnog kloniranja koja omogućuje sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad. Za razliku od Golden Gate metode, ova se metoda ne oslanja na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati. Pronašao ga je Daniel G. Gibson s Instituta J. Craig Venter. Ova tehnika je vrsta metode kloniranja neovisnog o sekvenci i ligazi (SLIC).
Slika 02: Gibson sklop
Procedura sklapanja Gibsona
Gibson Assembly treba fragmente DNK koji sadrže 20-40 parova baza koji se preklapaju sa susjednim fragmentima DNK. Preklapanja se dodaju putem PCR-a. Zatim se ti fragmenti DNK dodaju Gibson maser smjesi koja ima tri enzima. Ovaj se postupak provodi u izotermnim uvjetima (50 °C tijekom 1 sata) pomoću tri različita enzima: egzonukleaze, DNA polimeraze i DNA ligaze. Egzonukleaza žvače DNK s 5' kraja. Stoga ne inhibira aktivnost polimeraze i dopušta da se reakcija odvija u jednom procesu. Rezultirajuća jednolančana područja na susjednim fragmentima DNA mogu se žariti zbog preklapanja sekvenci. DNA polimeraza popunjava praznine dodavanjem nukleotida. Konačno, DNA ligaza kovalentno spaja DNA susjednih segmenata. Gibson Assembly obično koristi linearizirane odredišne vektore. Štoviše, ova metoda može istovremeno kombinirati do 15 fragmenata DNK na temelju sličnosti sekvenci.
Sličnosti između Golden Gatea i Gibson sklopa
- Golden Gate i Gibson Assembly dvije su metode molekularnog kloniranja.
- Obje metode mogu sastaviti više fragmenata DNK u jedan komad.
- Ove metode koriste odredišne vektore.
- Obje metode koriste termalne ciklere za sastavljanje više fragmenata DNK.
- Koriste se u mutagenezi usmjerenoj na mjesto.
Razlika između Golden Gatea i Gibson sklopa
Golden Gate je metoda molekularnog kloniranja koja se koristi u sastavljanju višestrukih fragmenata DNK u jedan komad oslanjajući se na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati, dok je Gibson Assembly metoda molekularnog kloniranja koja se koristi u sklapanje višestrukih fragmenata DNA u jedan komad bez oslanjanja na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati. Ovo je ključna razlika između Golden Gatea i Gibson Assemblyja. Nadalje, metoda Golden Gate koristi kružni vektor odredišta, dok metoda Gibson Assembly koristi linearizirani vektor odredišta.
Sljedeća infografika prikazuje razliku između Golden Gatea i Gibson Assemblya.
Sažetak – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekularno kloniranje je metoda koja se koristi za sastavljanje rekombinantnih molekula DNA i usmjeravanje njihove replikacije unutar organizama domaćina. Golden Gate i Gibson Assembly dvije su metode molekularnog kloniranja koje omogućuju sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad. Metoda Golden Gate oslanja se na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati, dok se Gibson Assembly ne oslanja na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati. Dakle, ovo je ključna razlika između Golden Gatea i Gibson Assembly.
