Ključna razlika – nitroceluloza naspram PVDF
Western blotting je metoda koja omogućuje detekciju i kvantifikaciju specifičnih proteina iz uzorka proteina. Pouzdanost tehnike ovisi o odabiru ispravne membrane za apsorpciju proteina iz gela. Postoje različite vrste mikroporoznih membrana. Nitrocelulozne i PVDF membrane dvije su takve membrane koje istraživači preferiraju zbog svojih posebnih svojstava u odnosu na druge vrste membrana. Odabir između nitroceluloze ili PVDF-a također je još jedan izazov u Western blottingu. I nitroceluloza i PVDF imaju visoku sposobnost apsorpcije proteina. Ključna razlika između nitrocelulozne i PVDF membrane je u tome što nitrocelulozne membrane nemaju sposobnost skidanja antitijela i ponovne upotrebe membrane za ponovno ispitivanje antitijela, dok PVDF membrane imaju sposobnost skidanja i ponovne upotrebe.
Što je nitroceluloza?
Nitroceluloza je polimer proizveden obradom celuloze dušičnom kiselinom i koristi se za izradu mikroporoznih membrana u molekularnoj biologiji, posebno za tehnike upijanja kao što su Southern, Northern i Western blotting. Veličine pora nitroceluloznih membrana kreću se od 3 do 20 µm. Nitrocelulozne mikroporozne membrane olakšavaju detekciju imunokemijske reakcije koja se odvija na površini membrane. Stoga se nitrocelulozne membrane često koriste za imobilizaciju proteina i detekciju specifičnih proteina u Western blotingu. Nitrocelulozne membrane također mogu imobilizirati glikoproteine i nukleinske kiseline.
Nitrocelulozne membrane preferiraju se u ispitivanjima bočnog protoka zbog nekoliko značajki. Nitrocelulozne membrane apsorbiraju proteine u visokoj koncentraciji. Otapalo koje se koristi za vlaženje membrane ne umanjuje apsorpciju proteina nitrocelulozne membrane. Nitrocelulozne membrane mogu se jednostavno rezati na željenu veličinu gela i prenositi proteine iz gela u membranu električnim ili kapilarnim prijenosom. Nitroceluloza omogućuje brži protok proteina kroz membranu s visokim potencijalom vezivanja. Nitroceluloza pokazuje poboljšanu snagu rukovanja. Još jedna posebna osobina nitroceluloznih membrana je da se mogu jednostavno zalijepiti ljepilom otpornim na vodu bez otapala na različite plastične podloge.
Slika 01: Nitrocelulozna membrana za Western blotting
Što je PVDF?
Poliviniliden difluorid (PVDF) je fluoropolimer proizveden polimerizacijom viniliden difluorida i ima visoku sposobnost imobilizacije proteina. Stoga se mikroporozne membrane izrađene od PVDF-a koriste u western blotting tehnikama za analizu specifičnih proteina iz mješavina proteina. PVDF membrane se također mogu koristiti za analizu aminokiselina i sekvenciranje proteina. Najvažnija karakteristika PVDF membrane u odnosu na nitroceluloznu membranu je ta da se s nje mogu lako ukloniti antitijela i ponovno upotrijebiti za sljedeće probe antitijela.
PVDF membrane deblje su od nitroceluloznih membrana; dakle, otporniji na oštećenja tijekom ponovne uporabe. PVDF membrane su visoko hidrofobne. Stoga se prije upotrebe moraju namočiti u metanol ili izopropanol.
Koja je razlika između nitroceluloze i PVDF-a?
Nitroceluloza vs PVDF |
|
| Nitroceluloza je polimer sastavljen od celuloze. | PVDF je fluoropolimer proizveden polimerizacijom viniliden difluorida. |
| Veličina pora na membrani | |
| Tipične veličine pora su 0,1, 0,2 ili 0,45μ | Tipične veličine pora su 0,1, 0,2 ili 0,45μm |
| Kapacitet vezanja proteina | |
| Nitroceluloza ima kapacitet vezanja proteina od 80 do 100 μg/cm2. | PVDF ima kapacitet vezanja proteina od 170 do 200 μg/cm2. |
| Osjetljivost | |
| Ovo ima nisku osjetljivost u usporedbi s PVDF-om. | Ovo ima visoku osjetljivost. |
| Detekcija slabo izraženih proteina | |
| Budući da je osjetljivost nitroceluloznih membrana niska, nije prikladna za detekciju slabo izraženih proteina. | Ovo je prikladnije za detekciju slabo izraženih proteina zbog svoje visoke osjetljivosti. |
| Pozadinska buka | |
| Ovo ima nižu pozadinsku buku | Ovo ima veću pozadinsku buku. |
| Interakcije s proteinima | |
| Molekule proteina vežu se za nitrocelulozne membrane kroz hidrofobne interakcije. | Proteini se vežu za PVDF membrane kroz hidrofobne i dipolne interakcije. |
| Priroda membrane | |
| Nitroceluloza je krta i lomljiva. Međutim, dostupne su verzije nitroceluloze koje su otporne. | PVDF je izdržljiviji i ima veću kemijsku otpornost. |
| Mogućnost skidanja i ponovne upotrebe | |
| Nitroceluloza može imati poteškoća pri skidanju i ponovnom ispitivanju bez gubitka signala. | PVDF je idealan za aplikacije ponovnog ispitivanja i sekvenciranja. |
| Prikladnost | |
| Nitroceluloza je idealna za otkrivanje proteina niske molekularne težine. | PVDF je prikladniji za otkrivanje proteina veće molekularne težine. |
| Ostala upotreba | |
| Nitroceluloza se može koristiti za analizu nukleinskih kiselina i dot/slot blotting. | PVDF se može koristiti za sekvencioniranje proteina i sustave ispitivanja čvrste faze. |
| Cijena | |
| Ovo je jeftinije od PVDF membrana. | Ovo je skuplje od nitroceluloznih membrana. |
| Potreba za prethodnim vlaženjem | |
| Nitrocelulozne membrane ne zahtijevaju prethodno namakanje metanolom | PVDF membrane zahtijevaju prethodno namakanje metanolom. |
Sažetak – Nitroceluloza naspram PVDF
Nitrocelulozne membrane bile su prve komercijalno korištene membrane za analizu bočnog protoka. Imaju visoku sposobnost apsorpcije proteina. Stoga se u Western blottingu koriste nitrocelulozne membrane. PVDF je još jedna vrsta membrane koja se koristi u Western blottingu i također ima visoku sposobnost apsorpcije proteina. Obje se vrste koriste u Western blottingu za analizu proteina. Međutim, PVDF membrane imaju više posebnih svojstava, što ih čini prikladnijima od nitroceluloznih membrana za Western blotting. No, nitrocelulozne membrane su prikladnije za detekciju proteina niske molekularne težine, PVDF membrane su prikladnije za detekciju proteina visoke molekularne težine. Ovo je razlika između nitroceluloznih i PVDF membrana.
