Ključna razlika – topla naspram hladne tripsinizacije
Topla i hladna tripsinizacija dvije su metode koje se koriste u enzimatskoj dezagregaciji stanica u uzgoju životinjskih stanica. Ključna razlika između tople i hladne tripsinizacije, kao što imena sugeriraju, ovisi o temperaturi na kojoj se dodaje tripsin za stanično razlaganje. Topla tripsinizacija odvija se u uvjetima više temperature (36,5 – 37 0C), dok se hladna tripsinizacija odvija u uvjetima niske temperature.
Tijekom procesa primarnog uzgoja životinjskih stanica koriste se tri glavne metode koje su se pokazale uspješnima. Tri metode uključuju mehaničku dezagregaciju stanica, enzimatsku dezagregaciju stanica i tehniku primarne eksplantacije. Enzimska dezagregacija stanica dovodi do izolacije stanica, a vrši je enzim tripsin koji razgrađuje proteine. Stoga je ovaj proces poznat kao tripsinizacija. Tripsinizacija se može provesti pod dva različita uvjeta, naime toplom tripsinizacijom i hladnom tripsinizacijom. Topla tripsinizacija je metoda tretiranja stanica tripsinom u toplim uvjetima na temperaturi od 36,5 – 37 0C. Hladna tripsinizacija je proces obrade tripsinom koji se odvija u hladnijim uvjetima, po mogućnosti u ledu, održavajući vrlo niske temperature.
Što je topla tripsinizacija?
Tripsinizacija se može provesti da se stanične komponente razdvoje kako bi se izolirale stanice za proizvodnju primarne stanične kulture. Tripsin je enzim za razgradnju proteina, a smjesa enzima koja se koristi u tripsinizaciji može biti ili sirovi ekstrakt ili pročišćeni proizvod. Kaže se da je sirovi ekstrakt učinkovitiji u razgradnji proteina i razgradnji stanica budući da sadrži druge degradativne enzime.
Topla tripsinizacija je najčešće korištena enzimatska metoda za dezagregaciju stanica koja se odvija u uvjetima viših temperatura. Prije tretmana tripsinizacijom željeno tkivo se usitnjava na manje komade. Olakšava jednostavan proces rastavljanja. Nasjeckano tkivo zatim se pere u posebnom mediju poznatom kao medij za disekciju bazalne soli.
Nakon završetka koraka pranja, stanice se pretvaraju u tikvicu koja sadrži aktivni enzim, a to je tripsin. Kako ova tehnika podrazumijeva topli protokol tripsinizacije, tripsin se stavlja na temperaturu od oko 37 0C oko četiri sata.
Slika 01: Tripsin
Sadržaj se miješa i miješa korištenjem metoda centrifugiranja radi lakšeg protokola i ubrzanja procesa dezagregacije. Nakon što se postigne preporučeno vrijeme, stanice se mogu izvući iz supernatanta. Stanice izvedene iz supernatanta se zatim inkubiraju na određenoj temperaturi i vremenu.
Što je hladna tripsinizacija?
Hladna tripsinizacija je druga vrsta tripsinizacije koja se odvija u hladnim uvjetima. U ovoj tehnici, stanice koje su nasjeckane i isprane stavljaju se u bočice na led i zatim natapaju tripsinom. Razdoblje namakanja je znatno duže – oko 6 – 24 sata.
Nakon završetka postupka namakanja, tripsin se uklanja iz staničnog lizata, a komadići tkiva se dalje inkubiraju na 37 0C oko 20 – 30 minuta. Dezagregacija stanica se postiže ponavljanim pipetiranjem mješavine tkiva. To će omogućiti stanicama da se odvoje od membrane i dođu do supernatanta. Kada su stanice u supernatantu, inkubiraju se i uzgajaju na željenoj temperaturi i vremenskom razdoblju.
Metoda hladne tripsinizacije ima nekoliko prednosti
- Veći prinos održivih stanica jer je oštećenje stanica minimalizirano. Oštećenje stanica je minimalizirano ako se ne koriste koraci centrifugiranja.
- Vrlo praktična metoda.
- Manje naporno.
Glavno ograničenje metode hladne tripsinizacije je da se velike količine ne mogu koristiti u jednom slučaju.
Koje su sličnosti između tople i hladne tripsinizacije?
- Postupci tople i hladne tripsinizacije koriste enzim tripsin za rastavljanje stanica.
- Postupci tople i hladne tripsinizacije koriste se u postupcima stanične kulture za rastavljanje stanica.
- U postupcima liječenja toplom i hladnom tripsinizacijom, stanice se dobivaju iz supernatanta.
Koja je razlika između tople i hladne tripsinizacije?
Topla naspram hladne tripsinizacije |
|
| Topla tripsinizacija je metoda tretiranja stanica tripsinom u toplim uvjetima na temperaturi od 36,5 – 37 0. | Hladna tripsinizacija je proces obrade tripsinom koji se odvija u hladnijim uvjetima, po mogućnosti u ledu, održavajući vrlo niske temperature. |
| Protokol | |
| Nasjeckani komadići tkiva održavaju se na 37 0C kontinuirano tijekom postupka. | Nasjeckani komadi tkiva prvo se drže na ledeno hladnim temperaturama, a zatim se održavaju na 37 0. |
| Temperatura | |
| Topla tripsinizacija javlja se na 36,5 – 37 0 | Hladna tripsinizacija javlja se na ledeno hladnim temperaturama. |
| Potrošeno vrijeme | |
| Manje vremena potrebno za cijeli proces (oko 4 sata) tople tripsinizacije. | Potrebno je duže vrijeme (oko 6 – 24 sata) za hladnu tripsinizaciju. |
| Prinos živih stanica | |
| Niska topla tripsinizacija. | Visoka hladna tripsinizacija. |
| Korištenje centrifugiranja | |
| Centrifugiranje je potrebno za dezagregaciju stanica u toploj tripsinizaciji. | Centrifugiranje nije potrebno kod hladne tripsinizacije. |
| Početna količina tkiva za tripsinizaciju | |
| Veća količina tkiva može se koristiti u toploj tripsinizaciji. | U hladnoj tripsinizaciji može se koristiti manja količina tkiva. |
| Oštećenje stanica | |
| Visoka zbog centrifugiranja u toploj tripsinizaciji. | Manje zbog hladne tripsinizacije. |
Sažetak – Topla naspram hladne tripsinizacije
Tripsinizacija je metoda korištenja enzima tripsina koji razgrađuje proteine za rastavljanje i pripremu primarnih staničnih kultura tijekom procesa uzgoja stanica. Postoje dvije glavne tehnike tripsinizacije na temelju temperatura koje se koriste tijekom postupka. To su topla i hladna tripsinizacija. Topla tripsinizacija se provodi na 37 0C dok se hladna tripsinizacija provodi u ledeno hladnim uvjetima. Iako hladnoj tripsinizaciji treba dulje vrijeme za završetak, kaže se da ima veći prinos živih stanica. To je zbog činjenice da je oštećenje stanica minimalizirano u hladnoj tripsinizaciji jer ne koristi snažne korake centrifugiranja. Ovo je razlika između tople i hladne tripsinizacije.
