Ključna razlika između kromatofokusiranja i izoelektričnog fokusiranja je u tome što je kromatofokusiranje vrsta kromatografske metode na stupcu koja koristi smole za ionsku izmjenu dok je izoelektrično fokusiranje vrsta tehnike elektroforeze koja koristi imobilizirane gelove pH gradijenta.
Kromatofokusiranje i izoelektrično fokusiranje dvije su tehnike koje razdvajaju proteine prema njihovim izoelektričnim točkama. I kromatofokusiranje i izoelektrično fokusiranje imaju veliku moć razlučivanja. Kromatofokusiranje je metoda kromatografije na stupcu visoke rezolucije, dok je izoelektrično fokusiranje metoda elektroforetske separacije. Štoviše, kromatofokusiranje ne koristi električno polje dok je za izoelektrično fokusiranje potrebno električno polje.
Što je kromatofokusiranje?
Kromatofokusiranje je vrsta kromatografije visoke elucije koja razdvaja proteine prema razlikama u njihovoj izoelektričnoj točki. Koristi kolonu smole za ionsku izmjenu i interno razvijen pH gradijent. Za razliku od izoelektričnog fokusiranja, kromatofokusiranje ne uključuje električno polje. Kromatofokusiranje je snažna tehnika pročišćavanja koja može razlučiti vrlo slične molekule koje se čak razlikuju samo za 0,02 pH jedinice. Stoga je kromatofokusiranje najprikladnije kao završni korak poliranja kada je potrebna visoka rezolucija za odvajanje vrlo sličnih komponenti.
Kod kromatofokusiranja, uzorak se nanosi na kolonu miješanjem s početnim puferom. Proteini koji imaju pH iznad svoje izoelektrične točke negativno su nabijeni i ostaju pri vrhu stupca, dok ostali proteini koji imaju pH ispod svoje izoelektrične točke migriraju niz stupac. Protein s najvišom izoelektričnom točkom eluira se prvi, dok se protein s najnižom izoelektričnom točkom eluira zadnji iz kolone. Na ovu tehniku utječe nekoliko čimbenika kao što su taloženje proteina i linearnost pH gradijenta.
Što je izoelektrično fokusiranje?
Izoelektrično fokusiranje je tehnika koja razdvaja različite molekule na temelju njihove izoelektrične točke. Također je poznato kao elektrofokusiranje. Ova tehnika se često koristi za odvajanje proteina u gelu. Kod izoelektričnog fokusiranja, uzorak se dodaje u imobilizirane gelove pH gradijenta (IPG). IPG gel je matrica akrilamidnog gela kopolimerizirana s pH gradijentom. Proteini migriraju prema katodi dok ne pronađu pH područje svojih izoelektričnih točaka. Kada protein dosegne pH koji nema neto naboj, migracija prestaje i daje stacionarnu traku. Isto tako, svaki protein daje traku na točki u pH gradijentu koja odgovara njegovoj izoelektričnoj točki.
Slika 01: Izoelektrično fokusiranje
Izoelektrično fokusiranje je prvi korak dvodimenzionalne gel elektroforeze. U toj tehnici, proteini se prvo odvajaju prema njihovim izoelektričnim točkama izoelektričnim fokusiranjem, a zatim se odvajaju prema njihovoj molekularnoj težini putem SDS-PAGE.
Koje su sličnosti između kromatofokusiranja i izoelektričnog fokusiranja?
- Kromatofokusiranje i izoelektrično fokusiranje dvije su metode visoke rezolucije.
- Obje se temelje na izoelektričnoj točki proteina.
- Ove tehnike koriste pH gradijent.
- Oba postupka su informativna za karakterizaciju varijanti ljudskog hemoglobina.
- Mogu razlučiti molekule gdje se pI vrijednosti razlikuju za samo 0,02 pH jedinice.
Koja je razlika između kromatofokusiranja i izoelektričnog fokusiranja?
Kromatofokusiranje je tehnika kromatografije na stupcu visoke rezolucije koja razdvaja proteine prema njihovoj izoelektričnoj točki. Nasuprot tome, izoelektrično fokusiranje je elektroforetska tehnika koja razdvaja proteine prema njihovoj izoelektričnoj točki primjenom električnog polja duž pH gradijenta formiranog u kapilari. Dakle, ovo je ključna razlika između kromatofokusiranja i izoelektričnog fokusiranja.
Još jedna razlika između kromatofokusiranja i izoelektričnog fokusiranja je ta što kromatofokusiranje ne uključuje električno polje dok je za izoelektrično fokusiranje potrebno električno polje.
Sažetak – kromatofokusiranje u odnosu na izoelektrično fokusiranje
Kromatofokusiranje i izoelektrično fokusiranje dvije su slične tehnike koje imaju visoku sposobnost razlučivanja molekula, osobito vrlo sličnih molekula. Kromatofokusiranje je tehnika kromatografije na stupcu visoke rezolucije dok je izoelektrično fokusiranje metoda elektroforeze. Kromatofokusiranje ne uključuje električno polje, za razliku od izoelektričnog fokusiranja. Dakle, ovo sažima razliku između kromatofokusiranja i izoelektričnog fokusiranja.
