Ključna razlika – AFLP vs RFLP
DNK studije imaju golemu važnost u razumijevanju i određivanju filogenetskih odnosa, dijagnosticiranju genetskih bolesti i mapiranju genoma organizama. Nekoliko tehnika povezanih s analizom DNK također se koristi za identifikaciju određenog gena ili sekvence DNK u grupi nepoznate DNK. Poznati su kao molekularni markeri. Polimorfizam duljine pojačanog fragmenta (AFLP) i polimorfizam duljine restrikcijskog fragmenta (RFLP) dva su takva molekularna markera (metode) razvijena u molekularnoj biologiji za otkrivanje genetske varijacije između organizama. Obje metode su jednako važne i imaju prednosti i nedostatke. Ključna razlika između AFLP i RFLP je u tome što AFLP uključuje selektivno PCR umnožavanje probavljene DNA dok RFLP ne uključuje selektivno PCR umnožavanje fragmenata DNA.
Što je AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) važan je alat u molekularnoj biologiji i intenzivno se koristi u analizi genetske varijacije. AFLP se temelji na specifičnoj PCR amplifikaciji fragmentirane genomske DNA i detekciji polimorfizma autoradiografijom putem gel elektroforeze. AFLP uvelike doprinosi identificiranju genetskih razlika u sojevima ili blisko srodnim vrstama raznih kraljevstava uključujući biljke, životinje, bakterije i gljive. AFLP se može provesti s malim količinama nepoznatih uzoraka DNK. Ne zahtijeva prethodno poznavanje slijeda i projektiranje sondi.
Koraci AFLP
- Izolacija DNK
- Probava DNK restrikcijskim endonukleazama
- Vezivanje ograničenih fragmenata DNA s adapterima
- Selektivna amplifikacija fragmenata sa specifičnim restrikcijskim mjestima
- Razdvajanje PCR proizvoda elektroforezom u gelu
- Vizualizacija gel matrice autoradiografom
AFLP je osjetljivija i ponovljivija metoda koja se može koristiti u profiliranju DNK nekoliko taksona uključujući gljive, bakterije, biljke i životinje bez prethodnog znanja o sekvencama DNK. Pomaže u prepoznavanju malih razlika među pojedincima u populaciji zbog svoje vrlo osjetljive prirode. AFLP je također važan u mapiranju genoma, forenzičkim studijama, roditeljskom testiranju, genotipizaciji itd.
Slika 01: AFLP
Što je RFLP?
Restrikcijski polimorfizmi duljine fragmenata (RFLPs) je tehnika koja se koristi za otkrivanje genetskih varijacija u homolognim sekvencama DNA. To je prva metoda razvijena za profiliranje DNK. Organizmi imaju jedinstvene DNK otiske prstiju ili DNK profile. RFLP služi kao važan alat za analizu varijacija između DNK profila intraspecifičnih ili blisko srodnih organizama budući da homologne sekvence imaju različita restrikcijska mjesta (lokacije) koja su jedinstvena za određeni organizam. Kada se homologna DNK probavi specifičnim restrikcijskim endonukleazama, to će rezultirati različitim profilima DNK koji su jedinstveni za svakog pojedinca. Stoga je princip ove metode otkrivanje genetske varijacije među organizmima restrikcijom homologne DNA specifičnim restrikcijskim enzimima i analizom polimorfizma duljine fragmenata putem gel elektroforeze i blottinga. Uzorci mrljanja jedinstveni su za svaki organizam i karakteriziraju specifične genotipove.
Koraci RFLP-a
- Izolacija dovoljne količine DNK iz uzoraka
- Fragmentacija uzoraka DNA specifičnim restrikcijskim endonukleazama u kratke sekvence
- Odvajanje dobivenih fragmenata različitih duljina elektroforezom u agaroznom gelu.
- Prijenos profila gela u membranu Southern blottingom
- Hibridizacija membrane s obilježenim probama i analiza polimorfizma dužine fragmenata u svakom profilu
RFLP je vrlo važna tehnika u otkrivanju nasljeđa bolesti i pronalaženju rizika od pojave bolesti među članovima obitelji. RFLP se također često koristi u mapiranju genoma, identificiranju kriminalaca u forenzici, testiranju očinstva itd. RFLP ima i nekoliko ograničenja. RFLP zahtijeva prethodno poznavanje podataka o sekvencama za dizajniranje sondi za hibridizaciju. Također zahtijeva izolaciju dovoljne količine DNK iz uzorka za analizu, što je teško u forenzičkim studijama.
Slika 01: RRFLP mapiranje
Koja je razlika između AFLP i RFLP?
ALFP vs RFLP |
|
| AFLP uključuje selektivno PCR pojačanje digestirane DNK. | RFLP ne uključuje PCR osim ako nije PCR-RFLP. |
| Znanje niza | |
| Prethodno poznavanje niza nije potrebno. | Potrebno je prethodno poznavanje sekvence za dizajnirane RFLP sonde. |
| Pouzdanost | |
| Ovo je pouzdanije. | Ovo je manje pouzdano u usporedbi s AFLP-om. |
| Učinkovitost u otkrivanju polimorfizma | |
| Ovo ima veću učinkovitost u otkrivanju polimorfizma nego RFLP. | Ovo je manje učinkovito u usporedbi s AFLP-om. |
| Cijena | |
| Ovo je malo skupo u usporedbi s RFLP-om. | Ovo je jeftinije u usporedbi s AFLP-om. |
| Aplikacije | |
| AFLP-ovi su primijenjeni za mapiranje genoma, DNK otiske prstiju, studije genetske raznolikosti, testiranje očinstva i forenziku | RFLP analiza važan je alat u mapiranju genoma, lokalizaciji gena za genetske poremećaje, određivanju rizika od bolesti i testiranju očinstva. |
Sažetak – AFLP vs RFLP
AFLP i RFLP dvije su tehnike koje se koriste kao genetski markeri za procjenu raznolikosti i procjenu genetskih odnosa u molekularnoj biologiji. AFLP služi kao učinkovitija i osjetljivija metoda za otkrivanje genetskog polimorfizma između organizama od RFLP-a. Međutim, iako obje ove metode imaju različitu učinkovitost u otkrivanju genetskih varijacija, još uvijek se koriste za DNK otiske prstiju i dijagnozu bolesti.
