Ključna razlika – RAPD naspram RFLP
Genetski markeri koriste se u molekularnoj biologiji za identifikaciju genetskih varijacija između jedinki i vrsta. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) i Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) dva su važna molekularna markera koja se rutinski koriste u laboratorijima. RAPD se izvodi s kratkim i proizvoljnim oligonukleotidnim početnicama, a temelji se na nasumičnom umnažanju višestrukih lokacija kroz predložak DNA organizma. RFLP se izvodi specifičnom restrikcijskom endonukleazom, a temelji se na polimorfizmu nastalih restrikcijskih fragmenata i hibridizaciji. Ključna razlika između RAPL i RFLP je ta što je RAPD vrsta PCR tehnike koja se izvodi bez prethodnog znanja o sekvenci, dok RFLP nije uključen u PCR i zahtijeva prethodno znanje o sekvenci za izvođenje tehnike.
Što je RAPD?
RAPD je koristan molekularni marker u molekularnoj biologiji. To je brza i jednostavna tehnika. RAPD se može definirati kao metoda koja rezultira polimorfnim sekvencama DNA kao rezultatom nasumičnog umnožavanja višestrukih lokacija ciljne DNA šablone. RAPD koristi kratke oligonukleotidne početnice s proizvoljnim sekvencama za PCR pojačanje. Primeri se umjetno sintetiziraju bez prethodnog znanja o slijedu. Stoga se smatra jednostavnom i korisnom tehnikom.
Sljedeći glavni koraci uključeni su u RAPD.
- Ekstrakcija ciljne DNA
- Amplifikacija višestrukih lokacija ciljne DNA pomoću nasumično odabranih početnica
- Gel elektroforeza pojačanih PCR proizvoda
- Bojanje etidijevim bromidom i identifikacija polimorfizma
Kao rezultat varijacije u žarenju primera, tijekom amplifikacije nastaju različiti fragmenti različitih duljina. Stoga se uzorci traka na gelovima razlikuju među jedinkama i vrstama. Stoga RAPD omogućuje detekciju genetske varijacije među organizmima u identifikaciji i diferencijaciji.
RAPD se primjenjuje u raznim studijama molekularne biologije kao što je identifikacija genetske razlike između blisko povezanih vrsta, mapiranje gena, DNK otisak prsta, identifikacija nasljednih bolesti itd.
Slika 01: RAPD
Što je RFLP?
Restrikcijski polimorfizmi duljine fragmenata (RFLPs) je molekularni marker koji se koristi u molekularnoj biologiji za identifikaciju genetske varijacije u homolognim sekvencama DNA. To je prvi genetski marker razvijen za DNK otiske. Svi organizmi proizvode jedinstvene DNK profile kada su ograničeni specifičnim restrikcijskim enzimima. RFLP služi kao važan alat u izradi jedinstvenih DNK profila pojedinaca i otkrivanju genetskih varijacija među njima. Kada se uzorci DNK probave specifičnim restrikcijskim endonukleazama, dobivaju se različiti profili DNK koji su jedinstveni za svakog pojedinca. Stoga je princip ove metode otkrivanje genetske varijacije među organizmima restrikcijom homologne DNA specifičnim restrikcijskim enzimima i analizom polimorfizma duljine fragmenata putem gel elektroforeze i blottinga. Uzorci mrljanja jedinstveni su za svaki organizam i karakteriziraju specifične genotipove.
Sljedeći koraci uključeni su u RFLP.
- Izolacija dovoljne količine DNK iz uzoraka
- Fragmentacija uzoraka DNA specifičnim restrikcijskim endonukleazama u kratke sekvence
- Odvajanje dobivenih fragmenata različitih duljina elektroforezom u agaroznom gelu.
- Prijenos profila gela u membranu Southern blottingom
- Hibridizacija membrane s obilježenim probama i analiza polimorfizma dužine fragmenata u svakom profilu
RFLP ima različite primjene kao što je dijagnoza nasljednih bolesti, mapiranje genoma, kriminalistička identifikacija u forenzičkim studijama, testiranje očinstva itd.
Slika 02: RFLP genotipizacija
Koja je razlika između RAPD i RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD je molekularni marker temeljen na nasumičnim početnicama i PCR-u. | RFLP je molekularni marker temeljen na proizvodnji restrikcijskih fragmenata različite duljine. |
| Potreban uzorak | |
| Mali uzorci DNK dovoljni su za RAPD analizu. | Velika količina ekstrahiranog uzorka DNK potrebna je za RFLP analizu. |
| Vrijeme | |
| RAPD je brz proces. | RFLP je dugotrajan proces. |
| Upotreba temeljnog premaza | |
| Koriste se nasumični primeri i isti primeri se mogu koristiti za različite vrste. | Sonde specifične za vrstu koriste se u RFLP za hibridizaciju. |
| Pouzdanost | |
| Pouzdanost tehnike je manja u usporedbi s RFLP. | RFLP je pouzdana tehnika. |
| Upijanje | |
| RAPD uključuje Southern blotting. | Southern blotting je jedan korak RFLP-a. |
| Detekcija alelne varijacije | |
| Alelne varijacije ne mogu se otkriti pomoću RAPD-a. | Alelne varijacije mogu se otkriti RFLP-om. |
| Potreba za znanjem sekvenci | |
| RAPD ne zahtijeva prethodno poznavanje slijeda. | Za projektiranje sonde potrebno je prethodno poznavanje sekvence. |
| PCR | |
| PCR je uključen u RAPD | PCR nije uključen u RFLP. |
| Reproducibilnost | |
| RAPD ima nisku obnovljivost | RFLP ima visoku reproducibilnost u usporedbi s RAPD-om. |
Sažetak – RAPD vs RFLP
RAPD i RFLP važni su markeri koji se koriste u molekularnoj biologiji. Obje metode sposobne su detektirati genetske varijacije među organizmima. RAPD se izvodi pomoću nasumičnih početnica. RFLP se izvodi pomoću specifičnih restrikcijskih enzima. Obje metode proizvode DNK profile jedinstvene za pojedinačne organizme. RAPD uključuje relativno nekoliko koraka nego RFLP. Ali proizvodi manje pouzdane i ponovljive rezultate od RFLP-a. Ovo je glavna razlika između RAPD i RFLP.
