Ključna razlika – SYBR Green protiv Taqmana
SYBR Green i Taqman dvije su metode koje se koriste za otkrivanje ili promatranje procesa amplifikacije PCR-a u stvarnom vremenu. SYBR Green je metoda koja se temelji na interkalirajućoj boji za bojenje nukleinske kiseline dok je Taqman metoda koja se temelji na probi hidrolize. Obje su tehnologije dizajnirane za stvaranje fluorescencije tijekom PCR-a, što omogućuje PCR stroju u stvarnom vremenu da prati reakciju u "stvarnom vremenu". SYBR Green metoda provodi se korištenjem fluorescentne boje nazvane SYBR green i detektira pojačanje vezanjem boje na proizvedenu dvolančanu DNA. Taqman se provodi korištenjem dvostruko obilježenih sondi i otkriva pojačanje razgradnjom sonde pomoću Taq polimeraze i otpuštanjem fluorofora. Ovo je ključna razlika između SYBR Greena i Taqmana.
Što je SYBR Green?
SYBR Green je fluorescentna boja koja se koristi za bojenje nukleinskih kiselina, posebno dvolančane DNK u molekularnoj biologiji. SYBR Green metoda koristi se za kvantificiranje PCR proizvoda tijekom PCR-a u stvarnom vremenu. Nakon što se veže s DNK, rezultirajući kompleks DNK i boje apsorbira plavo svjetlo i emitira intenzivno zeleno svjetlo. To se događa zbog strukturne promjene koja se događa u molekuli boje nakon vezanja s dvolančanom DNA. Kada PCR stvara sve više i više DNK, više molekula boje veže se za DNK, generirajući više fluorescencije. Stoga se fluorescencija povećava s nakupljanjem produkta PCR. Stoga se količina PCR produkta može kvantitativno izmjeriti detekcijom fluorescencije SYBR Green.
Zelena boja SYBR također se može koristiti za označavanje DNK u citometriji i fluorescentnoj mikroskopiji. Etidij bromid je uspješno zamijenjen SYBR Greenom jer je etidij bromid kancerogena boja s problemima odlaganja tijekom vizualizacije DNK u gel elektroforezi.
Postoje prednosti i nedostaci zelene metode SYBR. Ova metoda je vrlo osjetljiva, jeftina i jednostavna za korištenje. Međutim, zbog svoje sposobnosti da se veže na bilo koju dvolančanu DNA, nespecifično vezanje može dovesti do prekomjerne kvantifikacije PCR proizvoda.
Slika 01: SYBR zelena tehnika
Što je Taqman?
Taqman je alternativna metoda za SYBR Green za praćenje PCR procesa u stvarnom vremenu. Ova metoda ovisi o 5’ – 3’ egzonukleaznoj aktivnosti enzima Taq polimeraze za razgradnju sondi tijekom produženja novog lanca i oslobađanja fluorofora. U ovoj se metodi koriste dvostruko obilježene sonde, a temelji se na hidrolizi sondi. Sonde su fluorescentno obilježeni DNA oligonukleotidi koji imaju fluorescentnu reportersku molekulu (fluorofor) na 5’ kraju i molekulu gasitelja na 3’ kraju. Oni su dizajnirani da se vežu za jednolančani predložak na suprotnoj strani žarenja primera. Taq polimeraza dodaje nukleotide početnici i produžuje novi lanac prema dvostruko obilježenim probama. Jednom kada Taq polimeraza susretne sondu, djelovanje egzonukleaze Taq polimeraze aktivira i razgrađuje sondu. Nakon što završi sintezu novog lanca, sonda se podvrgava potpunoj degradaciji i oslobađanju fluorofora. Oslobađanje fluorofora stvara fluorescenciju. Fluorescent Quencher molekula učinkovito gasi emitirano svjetlo i stvara izlaz za kvantifikaciju PCR proizvoda. Oslobađanje fluorofora i količina PCR proizvoda su proporcionalni. Stoga se kvantifikacija može jednostavno izvršiti Taqmanovom metodom.
Slika 02: Taqmanova metoda
Taqmanova metoda koristi se u PCR-u u stvarnom vremenu, kvantifikaciji ekspresije gena, detekciji genetskih polimorfizama, kvantifikaciji delecija kromosomske DNA, identifikaciji bakterija, provjeri analize mikronizova, SNP genotipizaciji itd.
Koja je razlika između SYBR green i Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green se temelji na DNK vezivnoj boji. | Taqman ovisi o hibridizacijskim probama i 5’ do 3’ egzonukleaznoj aktivnosti Taq polimeraze. |
| Fluorescentno označene sonde | |
| Nisu potrebne fluorescentno obilježene sonde. | Potrebne su dvojno označene sonde. |
| Multipleksna analiza gena | |
| Ne može se koristiti za multipleksne ciljeve gena. | Može se koristiti za višestruke mete gena. |
| Cost | |
| Ovo je jeftinije. | Ovo je skuplje. |
| Specifičnost | |
| Ovo je manje specifično i veže se s bilo kojim dvolančanim DNK | Ovi su vrlo specifični budući da sonde otkrivaju specifične proizvode pojačanja. |
| Učinkovitost | |
| Ovo je manje učinkovito. | Ovo je vrlo učinkovito. |
| Aplikacija | |
| Ovo se koristi u PCR-u u stvarnom vremenu, vizualizaciji agaroznog gela, označavanju DNK itd. | Ovo se koristi u PCR-u u stvarnom vremenu, kvantifikaciji ekspresije gena, otkrivanju genetskih polimorfizama itd. |
Sažetak – SYBR Green i Taqman
Taqman i SYBR green dvije su metode koje se koriste u PCR-u u stvarnom vremenu (kvantitativnom PCR-u). Obje metode omogućuju učinkovito kvantifikaciju PCR proizvoda i oslanjaju se na emisiju fluorescencije. Taqmanova metoda koristi dvojno obilježene sonde za detekciju nakupljene DNK dok SYBR Green metoda koristi fluorescentnu boju. Obje ove metode također imaju različite primjene u molekularnoj biologiji.
